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Controle de Qualidade Microbiológico
Prof.ª Luciana Arantes Dantas


TESTE ENDOTOXINA “in vitro” LAL




Introdução
Sangue L.polyphemus caranguejo ferradura de cavalo formava gel sólido quando era removido do animal.
Estudos mostraram a origem do coágulo era dos amebócitos
1956 Bang - bactérias marinhas Gram (-) provocaram doenças fulminantes de coagulação
1964Levin e Bang – os amebócitos eram necessários para a reação
Introdução
Nakamura – estudo outra espécie comprovou presença de fatores coagulação
Cascata de coagulação
Ativação de 3 proteases:
FATOR B
FATOR C
PROENZIMA de Coagulação


Mecanismo de Reação
Enzima de Coagulação – dependente de Ca2+
Conversão do Coagulogênio emCoagulina
Mediada por ativação sequencial em amebócitos
Métodos Analíticos


Ponto final de Gelificação
• 0,1mL (solução teste)
• 0,1 mL reagente LAL
• Tubo despirogenizado
• Incubar 37o / 1h
• Inversão do tubo 180o


Cinética ( Abs / tempo)
Cinético Turbidimétrico
Colorimétrico
Quantitativo (ensaio limite)
Semi-quantitativo (diluiçãoda amostra geométrica)
Ponto final de Gelificação


Ensaio Gelificação
• Endotoxina
• Proenzima
• Enzima ativada
• Coagulogênio
• Coagulina
• GEL




Nível de endotoxina x Sensibilidade LAL
Ex:
Reagente LAL x Diluição = Endotoxina
Sensibilidade 1:16 [ 0,16 EU/mL]
0,01 EU/mL


Ensaio Turbidimétrico
•Endotoxina
• Proenzima
• Enzima ativada
• Coagulogênio
• Coagulina (turbidez)
• Leitura a 340 nm


Ensaio Cromogênico
• Endotoxina
• Proenzima
• Enzima ativada
• Coagulogênio + substrato
• Coagulina + p-nitroanilina
• Leitura a 405 nm (cor amarela)


Validação do Método
Abrangem:
comprovação da sensibilidade do LAL;determinação de efeitos inibidores ou exacerbadores provocados pelas substâncias integrantes da amostra; e
teste de compatibilidade do produto.
Nova validação:
mudança de fornecedor do LAL
mudança significativa na formulação/produção do produto


Sensibilidade do Lisado
• Todas as diluições devem ser feitas com água apirogênica, como Água Estéril para Injeção USP, eutilizando materiais apirogênicos.
• Deve ser executado com as quatro concentrações do padrão, em quadruplicata,
• Incluir controles negativos, que asseguram a condução adequada do procedimento.
• Os pontos finais serão determinados de acordo com as instruções do fabricante do reagente.
• Os resultados são considerados em conformidade se a média geométrica da concentração do pontofinal for ≥ 0,5 λ e ˂2 λ.

A sensibilidade do Reagente LAL é avaliada utilizando série de diluição do Padrão de Referência de Endotoxina (PRE) ou Padrão de Endotoxina (PE) com razão geométrica igual a 2, para obter as concentrações de: 0,25λ, 0,5 λ, e 2 λ,


λ é a sensibilidade do reagente LAL, em UE/mL, apresentada em sua rotulagem.
Sensibilidade do Lisado
Execução do Teste:Testes de Inibição e Exacerbação de Resposta
O ensaio LAL é baseado na reação de coagulação em seqüência de enzimas, induzida pela endotoxina.
Então, não surpreende encontrar produtos que provoquem a inibição ou que potencializem a reação.
É importante o conhecimento de que estas substâncias não são no geral constituintes inerentes aos produtos, particularmente no caso dosparenterais de grande volume e dos correlatos de medicamentos, sendo eventualmente no caso de fármacos.


Inibição ou Potencialização: maioria das substâncias são compostos de peso molecular relativamente alto formados de unidades repetitivas, com elevada incidência de polissacarídeos;


Substâncias que podem provocar Inibição ou Potencialização: derivados sanguíneos polinucleotídeos,...
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