Trabalho feito

Controle de Qualidade Microbiológico Prof.ª Luciana Arantes Dantas

TESTE ENDOTOXINA “in vitro” LAL

Introdução Sangue L.polyphemus caranguejo ferradura de cavalo formava gel sólido quando era removido do animal. Estudos mostraram a origem do coágulo era dos amebócitos 1956 Bang - bactérias marinhas Gram (-) provocaram doenças fulminantes de coagulação 1964 Levin e Bang – os amebócitos eram necessários para a reação Introdução Nakamura – estudo outra espécie comprovou presença de fatores coagulação Cascata de coagulação Ativação de 3 proteases: FATOR B FATOR C PROENZIMA de Coagulação

Mecanismo de Reação Enzima de Coagulação – dependente de Ca2+ Conversão do Coagulogênio em Coagulina Mediada por ativação sequencial em amebócitos Métodos Analíticos

Ponto final de Gelificação • 0,1mL (solução teste) • 0,1 mL reagente LAL • Tubo despirogenizado • Incubar 37o / 1h • Inversão do tubo 180o

Cinética ( Abs / tempo) Cinético Turbidimétrico Colorimétrico Quantitativo (ensaio limite) Semi-quantitativo (diluição da amostra geométrica) Ponto final de Gelificação

Ensaio Gelificação • Endotoxina • Proenzima • Enzima ativada • Coagulogênio • Coagulina • GEL

Nível de endotoxina x Sensibilidade LAL Ex: Reagente LAL x Diluição = Endotoxina Sensibilidade 1:16 [ 0,16 EU/mL] 0,01 EU/mL

Ensaio Turbidimétrico • Endotoxina • Proenzima • Enzima ativada • Coagulogênio • Coagulina (turbidez) • Leitura a 340 nm

Ensaio Cromogênico • Endotoxina • Proenzima • Enzima ativada • Coagulogênio + substrato • Coagulina + p-nitroanilina • Leitura a 405 nm (cor amarela)

Validação do Método Abrangem: comprovação da sensibilidade do LAL;