Pcr multiplex

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Secção Autónoma das Ciências da Saúde da Universidade de Aveiro, Ciências Biomédicas Técnicas Laboratoriais em Biomedicina, ano letivo 2011/12

Amplificação de fragmentos de DNA por PCR multiplex e análise por Eletroforese
Introdução
PCR – Contextualização teórica
A reação de polimerase em cadeia, ou PCR (polimerase chain reaction), é uma técnica de biologia molecular que se baseia noprocesso de replicação do DNA que ocorre in vivo. Através de uma molécula de DNA é possível obter milhares de cópias de fragmentos dessa molécula. Baseia-se no uso de um termociclador (figura 1), que através de ciclos de aquecimento e arrefecimento permite a desnaturação da cadeia de DNA e reações enzimáticas de amplificação. Para ser aplicável, a técnica de PCR requer o conhecimento de nucleótidos oude uma pequena sequência do fragmento de DNA a amplificar, pois há necessidade de preparar oligonucleótidos iniciais (primers), complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3’, de modo a permitir a atuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das cadeias simples constituintes do DNA a amplificar1,2. Uma PCR básica requer vários componentes e reagentes: o molde do DNA a amplificar; um primer reverse e um forward; uma DNA polimerase (normalmente, a taq polimerase produzida pela bactéria Thermus aquaticus, que tem a sua atuação ótima a 70 ºC); Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) que servem como substrato à DNA polimerase; uma solução tampão que cria um ambiente químico ótimo para a atuaçãoda DNA polimerase e iões Potássio e Magnésio que servem como co-fatores da reação 1,2.
A PCR é um método bastante sensível, daí ser bastante propenso a que ocorram erros. Fatores como as “hairpins” (estrutura secundária das moléculas de DNA), erros da polimerase, a concentração de magnésio, o tamanho do fragmento a amplificar, a ligação inespecífica dos primers, ligação do primer reverse aoprimer forward (“primer dimers”), ligação das dNTP’s ao magnésio e a contaminação são alguns dos fatores que interferem com a normal amplificação 2,5 por PCR .

Kary Mullis, em 1983 ao serviço da Cetus Corporation (uma das primeiras empresas de biotecnologia) foi o inventor da PCR. Mullis escreveu que descobriu a PCR enquanto viajava de cruzeiro pela costa do Pacífico, pensando em novas formas dedetetar mutações de DNA. Esta invenção valeu-lhe o prémio Nobel em 1993 4. O mesmo sumarizou a técnica do seguinte modo: “Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a 3 source of heat.”

Figura 1 - Imagem de umtermociclador comercializado pelo biorad. Adaptado de (5)

1

Secção Autónoma das Ciências da Saúde da Universidade de Aveiro, Ciências Biomédicas Técnicas Laboratoriais em Biomedicina, ano letivo 2011/12

Procedimento da PCR
Cada ciclo desta ampliação em cadeia é constituído por 3 passos fundamentais (figura 2) 1,2,5: a) Desnaturação do DNA alvo pelo calor (normalmente 1 minuto a 94 ºC) demodo a separar as duas cadeias; b) Associação dos primers por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeias simples (para permitir esta associação a mistura é arrefecida, sendo que a temperatura depende da % G/C da sequência a amplificar, ou seja, da força das ligações das sequências complementares por pontes de hidrogénio). Como os primers são adicionados em grande excesso, a probabilidade dereemparelhamento é inferior à da ligação dos primers ao local alvo, contudo é possível que o primer se ligue a uma sequência semelhante à sequência alvo levando à replicação de fragmentos não específicos; c) Extensão dos Primers através da síntese da cadeia complementar, por ação da DNA polimerase e na presença de magnésio e de um tampão adequado. Daqui resultam duas cadeias Figura 2 - Representação...
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