Real time
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PCR em tempo realRenato S. Carvalho rscarvalho@biof.ufrj.br IFRJ 22/05/09
Definição:
Técnica que combina a amplificação de uma sequência de DNA com a detecção do produto amplificado durante cada ciclo da reação
Objetivo:
Quantificação (absoluta ou relativa) da amostra de DNA/RNA inicial
n
P=Tinicial(1+E)
P=Produto final
E=Eficiência da reação
T=Template inicial
n=nº de ciclos
Se a eficiência da reação for 100%
P=Tinicial(2)n
Teórico
Real
10000000
1000000
LogDNA
100000
10000
1000
100
10
1
0
5
10
15
Ciclos
20
25
Fases da PCR
Linear
Log[DNA]
Exponencial
Platô
Detecção em gel com brometo de etídeo 0
10
20
Ciclos
30
Detecção da amplificação de uma PCR convencional Gel com brometo de etídeo
Detecção da amplificação em tempo real
O sinal de fluorescência é proporcional a quantidade de produto amplificado Hardware
Applied Biosystems 7500 Fast
Sistemas de detecção
-SYBR green
-Taqman
-Molecular beacons
-Scorpion probes
-LUX
-Plexor
Mais utilizados
Sistema SYBR green
Características
-Intercalante de DNA dupla fita
-Fluoróforo presente no master mix
-Inespecífico
-Não permite reações em multiplex
-Quanto mais longo o fragmento amplificado maior a fluorescência Tamanho ideal do fragmento: 150-200 bp
Sistema SYBR green
-Princípio
Sistema SYBR green
-Curva de dissociação
A curva de dissociação permite avaliar se há ou não geração de produtos inespecíficos
Sistema SYBR green
-Curva de dissociação
Sistema Taqman
Características
-Baseia-se na atividade 5’-3’ exonuclease da Taq polimerase -Funciona com sondas fluorescentes
-Altamente específico e sensível
-Não necessita de curva de dissociação
-Permite reações em multiplex
Sistema Taqman
Princípio
Sistema Taqman
Fluoróforos utilizados
-Referência passiva: ROX
-Repórteres: FAM, NED, VIC, JOE, HEX etc
-Quenchers: TAMRA e NFQ