Técnicas de Hibridização

UNICE - ENSINO SUPERIOR
IESF – INSTITUTO DE ENSINO SUPERIOR DE FORTALEZA
CURSO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR
PROF.:

TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO

Fortaleza-CE
2014
INTRODUÇÃO

O princípio das técnicas de hibridização é que duas fitas de ácidos nucléicos com sequências complementares tendem a formar uma fita dupla. Para detectar-se uma determinada sequência de material genético, imobiliza-se a mistura, como um genoma celular qualquer, em um suporte sólido e utiliza-se DNA fita simples marcado com um isótopo radioativo ou molécula fluorescente com a sequência de bases nitrogenadas que se deseja detectar. Southern blotting e Northern blotting são técnicas de hibridização de ácidos nucleicos que analisam respectivamente DNA e RNA, sendo empregadas em diagnósticos clínicos e na investigação fundamental (IFSC, 2014; OLIVIEIRA, 2010).

SOUTHERN BLOTTING

Na técnica de Southern blotting, a molécula de DNA é digerida por uma ou mais enzimas de restrição e separada por eletroforese em gel de agarose. Há desnaturação in situ de fragmentos de DNA fita dupla, esses fragmentos são transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose e imobilizados em um padrão de bandeamendo igual ao do gel, através de radiação UV para membranas de nylon e calor para as de nitrocelulose. Coloca-se uma membrana sobre o gel e adiciona-se um tampão salino de alta concentração, o qual passa através do gel por capilaridade e transfere os fragmentos de DNA para membrana. O resultado é uma membrana réplica do gel de agarose (MAPA, 2014).
Usam-se sondas de RNA ou DNA marcadas radioativamente. Acontece a hibridização do DNA fixo na membrana e uma autorradiografia revela qual fragmento de restrição contém o gene clonado (MAPA, 2014).

NORTHERN BLOTTING

No Northern blotting, uma técnica análoga ao Southern blotting, extrai-se o RNA e submete-se essa molécula à eletroforese em gel de agarose. Depois, transfere-se para uma