Enzimas

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CDD: 589.2

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UMA ENZIMA
EXTRA-CELULAR DE UM FUNGO TERMO-TOLERANTE
BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF AN EXTRACELLULAR ENZYME OF A HEAT-TOLERANT FUNGUS

WILLIAM BRANDANI DA SILVA1
ROSANE MARINA PERALTA2
1 Professor da UNIPAR
2 Professora da UEM

RESUMO
Este trabalho tem por objetivo caracterizar bioquimicamente uma enzima
amilásica extracelular de um fungode solo mesófilo (Aspergillus).
Palavras-chave: fungo; amilase; caracterização bioquímica

1. Introdução
As enzimas amilolíticas, hoje, têm um importante papel industrial.
Elas são usadas na produção de xarope de glucose, pela hidrólise do amido
da glucose, o qual geralmente é usado na produção do etanol.
Enzimas amilolíticas de fungos termófilos e termotolerantes têm sido

PUBLICATIOUEPG – Biological and Health Sciences, 6 (1): 7-19, 2000.

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procuradas, pois há passos nos processos industriais que necessitam de
enzimas resistentes a temperaturas mais elevadas.
O fungo filamentoso Aspergilus fumigatus é um fungo termotolerante.
Ele produz duas enzimas amilolíticas que foram pouco pesquisadas até o
presente momento. Uma cepa foi isolada pela Dra. Rosane Peralta e umacaracterização inicial de suas enzimas extracelulares realizada (PERALTA
e DOMINGUES, 1993; PLANCHOT e COLONNA, 1995; HIZUKURI et
al., 1988).

2. Materiais e métodos
2.1. Microorganismo
O fungo Aspergillus fumigatus usado foi isolado durante um programa de seleção de microorganismo do solo produtor de amilase (PERALTA
e DOMINGUES, 1993) e armazenado em meio ágar-batata a 4º C.
2.1.1.Condições de crescimento
Produção de enzima crua em cultura líquida. A suspensão de esporos
foi usada como inóculo erlenmeyer para 250 ml de meio de cultura Voguel
(MONTENECOURT e EVELEIGH, 1977) e farelo de aveia 2% dissolvido
no meio. O organismo foi cultivado a 30º C sem agitação. Depois de 6 dias,
o micélio foi filtrado sobre papel filtro e estocado a - 15º C para uso posterior.
Purificação deglucoamilase extracelular. O filtrado cru (100 ml) foi precipitado com sulfato de amônio, a 75% de saturação e a 4º C. Colocou-se o
precipitado (do filtrado cru da cultura citada acima e precipitado com sulfato de amônio) para centrifugar (11000 g, 30 minutos, - 40º C), dissolvido
em tampão KH2PO4- NaOH, 50 mM, pH 6, e o centrifugado insolúvel foi
removido (ressuspendido) e dialisado em membranade celulose porosa.
Passou-se o sobrenadante (volume 15 ml) por uma coluna de DEAE – celulose (50 ml), equilibrado com 100 ml de tampão acetato, depois eluído com
um gradiente de 0 mM a 300 mM de cloreto de sódio. Frações de 10mL
foram coletadas.
2.1.2. Testes enzimáticos
A atividade de digestão de amido das enzimas do filtrado de cultura
foi testada de dois diferentes modos:
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2.1.2.1 Teste da glucoamilase: mede a liberação de glicose do amido
pelo teste de glicose-oxidase-peroxidase (BERGMEYER e BERNT, 1974)
utilizando-se uma suspensão amido a 0,5% em tampão KH2PO4 - NaOH; 50
mM, pH6, 36º C, por 10 minutos.
2.1.2.2 Teste de α-amilase: A atividade dextrinizante do filtrado em
cultura foi determinada peloteste iodométrico, como descrito em Wilson e
Ingledew (1982).
Em ambos os casos, amostra de enzimas são diluídas apropriadamente para manter a linearidade sobre o intervalo do teste.
2.1.3. Cromatografia dos produtos de hidrólise
A ação de enzima sobre amido solúvel era monitorada em papel
cromatográfico em tempos de incubação fixos. A glucoamilase homogênea
(um ml contendo 0,669 Uenzimáticas) era incubada com um ml de amido
solúvel (0,5%) em KH2 PO4 - NaOH, tampão 50mM pH 6. Depois de 10
minutos e de duas horas, a reação era parada, fervendo-se e estocando-se a
-4º C, para uso posterior. Amostras (5 ml) foram colocadas sobre papel
Whatmam n. 1 e a cromatografia descendente realizou-se em temperatura
ambiente com um sistema de solvente, butanol, piridina e água (6-4-3)...
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