discussões de brandford.

O metodo de Brandford consegue separar proteínas totais com a utilização do corante Comassie Blue G-250 que faz interações com as proteínas que contém aminoácidos com cadeias laterais básicas ou aromáticas , assim tem-se a reação de deslocamento do equilíbrio químico do corante, o fazendo absorver fortemente em 590 nm.
Então em pH ácido o corante que é aniônico irá reagir com as proteínas que tem aminoácidos básicos ou aromáticos, formando um complexo e esse complexo acaba por influir na absorção de luz, ou seja, o corante livre se colocado no espectofotometro tem uma maior absorbância em 465 nm e quando o complexo( proteína + corante) é colocado no espectofotometro a sua maior absorbância é em 590 nm.
Esse método utilizará o espectofotometro, portanto aquela amostra que tiver uma maior absorbância no comprimento de onda 590 nm, conterá proteínas.
A solução de BSA( Albumina) 1 mg/mol, serve para a confecção da curva padrão em que as amostras de proteína estarão nela, ou seja, a curva padrão mostra as absorbâncias de BSA x concentração de BSA usando essa solução como padrão para as amostras, logo a maior absorbância dessa curva padrão de BSA nos mostrará que as absorbâncias das amostras devem estar dentro desta curva, ou seja, não ultrapassar esta maior absorbância. No gráfico plotado teremos as amostras dentro da curva padrão de BSA, logo é possível descobrir a concentração das proteínas nas amostras por equação de reta y= ax+b, em que y é a média das absorbâncias de BSA, x é a concentração de proteína e “a” e “b” são dados informados.
A diluição de BSA foi feita conforme as concentrações pedidas, então em 500 micro litros de BSA( 1 mg/ ml) foi diluído 500 micro litros de água destilada utilizando a pipeta volumétrica eletrônica, obtendo a primeira concentração 1 mg/ ml de BSA. Esta concentração foi utilizada no primeiro poço da placa de 96 “weels”.
Concentração de BSA
Média Absorbância BSA
Média Absorbância BSA- sem Branco.
( 0,530)
1 mg/ml
1,052