Determinação dos parâmetros cinéticos da

Laboratórios de Química II 2º Semestre - Ano Letivo 2011/2012 Curso: Bioquímica Trabalho Nº 11 – Determinação dos parâmetros cinéticos da polifenoloxidase

Introdução A caracterização de uma enzima passa necessariamente pela determinação dos seus parâmetros cinéticos. Estes devem ser determinados numa preparação de enzima do mais alto grau de pureza possível, para evitar a interferência de outros compostos presentes no extrato enzimático. Por exemplo a presença de inibidores ou de outras enzimas que também atuem sobre o substrato pode falsear significativamente os resultados obtidos. No entanto em muitos casos como primeira abordagem esta determinação poderá ser realizada utilizando um extrato enzimático, ou utilizando uma preparação da enzima parcialmente pura. Neste trabalho iremos comparar os parâmetros cinéticos da polifenoloxidase num extrato enzimático e numa preparação parcialmente pura preparada no trabalho anterior. A enzima será caracterizada relativamente à catálise da reação de oxidação do L-DOPA. Após determinação das velocidades de reação para diferentes concentrações de substrato os valores de Km e Vmax serão calculados utilizando os diversos métodos disponíveis: LineweaverBurk, Eadie-Hofstee e Hanes.

Material Espectrofotómetro Banho de Gelo Reagentes Tampão fosfato de sódio pH 6,8, 0,1M L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) 20 mM no tampão anterior

Procedimento Experimental Para determinar os parâmetros cinéticos determine a velocidade inicial da reação para cada uma das misturas reacionais que constam na tabela abaixo procedendo como no trabalho 10. 1

Para cada uma determine a variação de absorvância contra um branco em que o volume de extrato foi substituído por igual volume de água.

Tampão fosfato 0,1 M pH 6,8 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

L-DOPA 20 mM 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

H2O 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Extrato enzimático 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Repita o procedimento anterior utilizando a proteína parcialmente purificada