WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING
(LCM-FMRP-USP)

1) Tampão RIPA (manter em gelo durante utilização; adicionar o inibidor de protease e fosfatase no tubo falcon; verificar se há estoque – Tris, NaCl, EDTA e detergentes).

 Para 50 ml de Tampão
Tris = 0,3025 g
NaCl = 0,4383 g
EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) = 18,61 mg

Detergentes:
Triton X-100 = 500 μl
Deoxiglicolato = 500 mg
SDS = 50 mg

Inibidores protease:
Aprotinina = 250 μg
PMSF (phenylmethyl sulfonyl fluoride) = 8,71 mg  pesar em eppendorf e solubilizar em metanol (1mL)
Leupeptina = 1mg/ml (retirar da solução estoque  1mg leupeptina – 1ml de H2O milli-Q – manter à -20oC)

Inibidores fosfatase:
Ortovanadato Na = 94,5 mg
Pirofosfato Na = 225 mg
Fluoreto Na = 210 mg

 Para 10 ml de Tampão
Aprotinina = 50 μg
PMSF = 1,75 mg pesar em eppendorf e solubilizar em metanol (200μL)
Ortovanadato Na = 18,9 mg
Pirofosfato Na = 45 mg
Fluoreto Na = 42 mg
ACRILAMIDA/BIS (para 50ml) – 15g de Acrilamida e 0,4g de Bis-Acrilamida – Filtrar antes de completar com H2O milli-Q na proveta graduada.
PONCEAU S (para 50ml) – 100mg de Ponceau e 0,5ml de ácido acético – Completar com H2O milli-Q.

2) Tampão 10x Tris/Glicina/SDS pH = 8,3 – 8,4

 Para 1 l  Para 500 ml
Tris 25 mM 3,03g 1,515g
Glicina 192mM 14,41g 7,205g
SDS 0,1% (1g/1000ml) 1g 0,5 g
* TAMPÃO DE ELETROFORESE (tampão de corrida): 100 ml Tampão 10x + 900 ml H2O

3) Tampão de transferência
 Sistema semi-seco
PREPARAR apenas 500ml – Para transferir 4 géis/vez
Tris 48mM 2,91g
Glicina 39mM 1,47g
Metanol 100ml
SDS 10% 1,88ml pH 8,4 – 9,4 (não corrigir – somente conferir)
Preparar em béquer e homogeneizar com “pulga”.

 Em tanque (1x Towbin buffer – Towbin et al., 1979)
Tris 3,03g
Glicina 39mM 14,4g
Metanol 200ml pH 8,4 – 9,4 (não corrigir – somente conferir)
Preparar em béquer e homogeneizar com “pulga”.

4) Tampão da amostra (Laemmli) pH = 6,8 – SDS MIX NORMAL
 Para 15ml (TAMPÃO