Tecnologia do dna recombinante

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B om D ia!!

Universidade Federal do Rio de Janeiro
Campus Macaé

Disciplina: Biol Cel e Biotecnologia
Tecnologia do DNA Recombinante
Profa. Beatriz Ferreira

Tecnologia do DNA Recombinante

Watson & Crick
Estrutura do
química do DNA
(1953)

Nature, 25 - Abr - 1953

Tecnologia DNA
recombinante
Insulina recombinante
(1978)

Ian Wilmut
clonagem de mamífero
(1997) Tecnologia do DNA Recombinante

PGH
Conhecer genoma H. sapiens
(1995-2003)

Transgenia

Prática clínica

(1995...)

Testes genéticos
(1995...)

Tecnologia do DNA Recombinante

O que é um DNA recombinante?
- É uma molécula de DNA formada pela
ligação
ligação de duas moléculas de origens
diferentes (Ex. DNA de planta ligado a
um plasmídio)

Tecnologia do DNA Recombinante

“A“A engenharia genética atua no nível
molecular, onde as diferenças entre
espécies
espécies desaparecem”

Tecnologia do DNA Recombinante

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Tecnologia do DNA Recombinante

Descritas em 1970,
W. Alber

H. Smith

D. Nathans

• Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é
um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre
que identificar umaseqüência particular de nucleotídios
que seja o sítio de restrição da enzima;

Tecnologia do DNA Recombinante

Enzimas de Restrição
Enzimas

Tecnologia do DNA Recombinante

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural: proteger o DNA
bacteriano do DNA exógeno

Tecnologia do DNA Recombinante

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita:

BamHI

- reconhecemseqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando
como verdadeiras tesouras moleculares

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Sistema
Sistema de Restrição

Tecnologia do DNA Recombinante

Digestão Enzimática
Sítio de Restrição para EcoRI

DNA a ser digerido
e seus Sítios de
restrição
Sítios de Restrição para Hind II

Tecnologia do DNA Recombinante

Digestão Enzimática
Produtoda Digestão com a Enzima Hind II

Hind II

Hind II

Tecnologia do DNA Recombinante

Enzimas de Restrição
Enzimas

Tecnologia do DNA Recombinante

TIPOS DE VETORES

Tecnologia do DNA Recombinante

Vetores
Vetores

Plasmídeos

Vírus

Hospedeiros

Bactérias / leveduras

Utilização
clonagem

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PLASMIDIOS
• Plasmídios são moléculas deDNA circular, fita
dupla,
extracromossomais,
que
ocorrem
naturalmente em bactérias e algumas leveduras

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Vetor de Expressão em
Procarioto

PLASMIDIOS
rCanamicina

oriE
HindIII
XbaI

pUS974
4039 pb

RBS

hsp60
oriM
MT19

Tecnologia do DNA Recombinante

PLASMIDIOS
Vetor de Expressão em
Eucariotos

Tecnologia do DNA RecombinanteVÍRUS

Vírus que
bactérias;
-

infectam

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Tecnologia do DNA Recombinante

VÍRUS
Ciclo Lítico

Ciclo
Lisogênico

Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

CLONAGEM

DNA
plasmidial vetor

Fragmento de DNA inserto
LIGASE

Tecnologia do DNA Recombinante

CLONAGEM

Tecnologia doDNA Recombinante

• É o isolamento e a
propagação
propagação
em
um
organismo de moléculas
exógenas
de
DNA
identicas;

Tecnologia do DNA Recombinante

CLONAGEM

Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Replicação in vitro
Sistema que permite a amplificação de uma
determinadaregião do genoma
Isolamento e multiplicão de genes

Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

Componentes necessários para uma PCR;

Tecnologia do DNA Recombinante

Passos
Passos da PCR
Desnaturação inicial⇒5 minutos à 95ºC.
Seqüência de ciclos: ≈35 ciclos
1º- Desnaturação ⇒ 94ºC por 1min

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2º-Temperatura de anelamento do...
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