Sequenciamento de dna

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Sequenciamento de DNA – noções básicas

Paulo Paes de Andrade
Texto baseado na aula de sequenciamento do site www.biolmol.cjb.net

Até meados da década de 70 não era nada simples obter uma sequência de DNA, fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais complicado do que com proteínas e o conhecimento sobre os ácidos nucléicos avançava de forma lenta. No início dadécada de 80 uma técnica relativamente rápida de sequenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de uma cadeia de DNA com diferentes produtos químicos e a visualização dos fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcação radiativa das moléculas porque a quantidade de material produzida era muito pequena e não podia ser detectada de outra forma. Mesmocom todas estas dificuldades houve então um rápido progresso no conhecimento de sequências de DNA. Poucos anos depois um novo avanço tecnológico foi alcançado pela introdução da técnica de interrupção da sequência pela incorporação aleatória de um nucleotídeo modificado (sem a hidroxila na posição 3´), que ficou conhecida como técnica de didesoxi ou dideoxi. Esta técnica suplantou imediatamente aanterior e permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automáticos de DNA, sobre os quais versa este capítulo. Ainda se faz eventualmente o sequenciamento manual, mas é muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substâncias radiativas. De uma forma geral quando desejamos saber uma sequência de bases de um fragmento qualquer de DNA, purificamos o fragmento e enviamos para sequenciamentonuma empresa prestadora deste serviço.

Mas, afinal, como produzir um DNA para sequenciamento e do que se trata a técnica de dideoxi?

A primeira parte da pergunta é crucial: de fato, se queremos sequenciar um trecho de DNA, temos que ter uma grande quantidade dele no nosso tubo de ensaio. Duas formas corriqueiras de se obter grandes quantidades de uma determinada sequência de DNA são aclonagem em plasmídeo e a PCR. Se o DNA que queremos sequenciar for o inserto de um plasmídeo, tudo o que precisamos é crescer 200 microlitros da bactéria com o plasmídeo e, empregando as técnicas já usuais de extração de DNA, obter o plasmídeo purificado que será empregado na reação de sequenciamento.  Se ainda não tivermos o material clonado, podemos empregar a PCR e amplificar o trecho a sersequenciado, purificando a banda do gel ou obtendo o fragmento purificado por cromatografia de afinidade e usando o material assim obtido para iniciar a reação do sequenciamento. Neste caso, precisamos saber apenas as sequências das extremidades do trecho a ser sequenciado.  É aí que vão parear os primers para sequenciamento, um de cada vez.

A segunda parte da pergunta exige uma explicação maisdetalhada.

Inicialmente, temos que recordar o que seja um didesoxinucleotídeo trifosfasto, ou ddNTP.  O precursor normal da síntese de DNA é o dNTP, ou desoxiribonucleotídeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila na posição 3´. É a partir desta hidroxila que a fita nascente é estendida. Um ddNTP, entretanto, não tem esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a incorporaçãode outros nucleotídeos a partir dele. Se o ddNTP for marcado associado à radiação ou fluorescência, a fita interrompida ficará radiativa ou fluorescente e poderá ser detectada mais facilmente (Figura 1, abaixo) . Para fins desta aula vamos admitir que cada didesoxinucelotídeo está marcado com uma florescência diferente. Portanto, as fitas terminadas em A, T, G ou C vão emitir cores diferentesquando excitadas com luz de um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser).

Figura 1: Princípio da interrupção da cadeia nascente de DNA pela incorporação de um didesoxinucleotídeo. Na esquerda, a extensão da cadeia é garantida pela adição de um desoxinucleotídeo trifosfatado. A retirada de dois fosfatos e a reação com a hidroxila formam a ligação fosfodiéster entre o nucleotídeo da...
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