Apresentação sequenciamento de dna

Universidade de São Paulo
Instituto de Química de São Carlos
SQM0416 – Bioquímica II

Douglas MS
São Carlos, novembro de 2012

Compreende bioquímicos;

uma

série

de

processos

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Tem por objetivo determinar a sequencia de nucleotídeos na molécula de DNA;

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Na década de 50, James Watson e Francis Crick descobrem a estrutura do DNA; Publicam na revista Nature o artigo

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“Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”;

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O DNA se estrutura na forma de uma dupla hélice e as bases nitrogenadas se ligam aos pares por ligações de H;

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Até a década de 70 era extremamente difícil obter a sequencia dos ácidos nucleicos, mesmo os pequenos (5 a 10 nucleotídeos); Em 1977 surgem duas novas técnicas para o sequenciamento do DNA; Uma pelos cientistas Alan Maxam e Walter Gilbert e outra por Frederick Sanger;

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Maxam e Gilbert: degradação química do DNA;
◦ Tratamento com substâncias químicas que lisam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos;

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Sanger: sequenciamento enzimático, dideoxi ou de término de cadeia;
◦ Síntese enzimática de fita complementar, cujo comprimento é interrompido pela adição de dideoxinucleotídeo;

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Degradação Química;

◦ Primeiramente, a fita dupla de DNA é marcada com 32P, na extremidade 5’ da dupla fita. A enzima polinucleotídeo quinase catalisa esse processo; ◦ À dupla fita adiciona-se dimetilsulfato, seguido de aquecimento (90 °C). As ligações de H são rompidas, separando as duas fitas do DNA; ◦ A amostra é separada em 4 tubos, onde em cada tubo ocorrerá a clivagem da fita num determinado nucleotídeo ou par de nucleotídeos; ◦ A amostra de cada tubo é submetida à eletroforese e o gel é usado para posterior revelação radiográfica, revelando a sequencia encontrada dos nucleotídeos (extremidade marcada);

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Degradação Química:

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Sequenciamento Enzimático:
◦ A fita dupla de DNA a ser sequenciado deve ser separada em suas fitas