Sequenciamento de dna pela plataforma 454

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SEQUENCIAMENTO DE DNA PELA PLATAFORMA 454

As novas tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de sequenciamento de nova geração, começaram a ser comercializadas em 2005. E estão evoluindo rapidamente. Todas essas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. Dentre as novasplataformas de sequenciamento, duas já possuem ampla utilização em todo o mundo: a plataforma 454 FLX da Roche e a Solexa da Illumina.em síntese, o pirosequenciamento (RONAGHI et al., 1998). A leitura da sequência nesse sistema é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas que se inicia com a liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de umdesoxinucleotídeo à cadeia. Em seguida,esse pirofosfato é convertido para ATP, pela ATP sulfurilase, sendo este utilizado pela luciferase para oxidar a luciferina, produzindo um sinal de luz

O sistema requer que o DNA seja mecanicamente fragmentado em sequências de 300 – 800pb, transformado em fragmentos abruptos fosforilados e ligado a adaptadores de sequência específica (Figura 1). A biblioteca de DNA da amostra é ligada aadaptadores A e B nas extremidades 3’ e 5’ dos fragmentos, respectivamente, os quais são utilizados nas etapas posteriores de isolamento dos fragmentos (A-B) e amplificação e nas reações de sequenciamento.
O adaptador B possui biotina ligada à extremidade 5’, o que permite o isolamento dos fragmentos ligados ao adaptador A na extremidade 3’ e adaptador B na extremidade 5’ na amostra. Somente osfragmentos AB são eluídos na reação de purificação e são especificamente ligados às microesferas que carregam várias cópias da sequência complementar exata ao adaptador B de um único fragmento (MARGULIES et al., 2005). O outro adaptador é utilizado no anelamento do primer que inicia a reação de sequenciamento. As microesferas ligadas aos fragmentos únicos de fita simples são então emulsionadas em umamistura de água e óleo com reagentes de PCR para amplificação clonal do fragmento fita simples em cerca de 1 milhão de cópias. Na PCR em emulsão, o óleo em solução aquosa forma micelas, nas quais as microesferas são
capturadas. Cada micela funcionará como um microrreator, produzindo muitas cópias idênticas de um mesmo fragmento isoladamente em um microssuporte.
Após a PCR de emulsão, asmicroesferas ligadas aos fragmentos de fita simples são depositadas em poços distintos em uma placa de sílica onde os reagentes para o sequenciamento são distribuídos. As reações de sequenciamento ocorrem em cada poço,
para um único tipo de fragmento ligado à microesfera, não havendo, portanto,competição por reagentes com outros fragmentos da biblioteca. A placa de
sequenciamento é dividida em 1,6 milhõesde poços com diâmetro suficiente para alojar uma única microesfera .
A placa de sequenciamento é inserida junto ao sistema óptico de leitura no equipamento. Os reagentes e as soluções de sequenciamento são então distribuídos por toda a placa a cada ciclo para obtenção do sequenciamento paralelo dos 1,6 milhões de poços.
O sequenciamento é realizado em ciclos, e a cada ciclo um tipo determinadode nucleotídeo é adicionado à reação. Se o nucleotídeo adicionado for incorporado à
sequência em síntese, um sinal de luz é emitido, sendo a intensidade desse sinal um reflexo do número de nucleotídeos desse tipo específico que foram sucessivamente incorporados na molécula. Como o nucleotídeo que é adicionado a cada ciclo é conhecido,
O sinal de luz emitido pode ser diretamente utilizado comoinformação de sequência Os fragmentos sequenciados nessa plataforma passam por sistemas de análise de qualidade
em que sequências distintas oriundas do sequenciamento de uma única microesfera são
eliminadas, bem como as leituras em que a sequência inicial TCGA (quatro primeiros nucleotídeos dos adaptadores) não aparece. As leituras produzidas possuem geralmente cerca de 250pb, o que representa...
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