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Apontamentos Genética – 1º Teste

Aula nº1 – Extracção não enzimática de DNA de leucócitos a partir de sangue

Objectivo
 Extracção de DNA dos glóbulos brancos, a partir de sangue;
 Extracção é feita a partir de glóbulos brancos uma vez que glóbulos vermelhos adultos já não têm núcleo.

Reagentes utilizados
Tampão TKM-1
 Tris-HCl
- Tampão que mantém pH estável
 MgCl2
-Dissocia-se em co-iões
- Catiões aos grupos fosfatos protegendo a integridade do DNA
 EDTA
- Impede a acção das nucleases
- Agente quelante que se liga a iões que são cofactores das nucleases
- Anticoagulante do tipo não heparínico que inibe reacções enzimáticas
 KCl
- Dissocia-se em co-iões
- Catiões aos grupos fosfatos protegendo a integridade do DNA

Tampão TKM-2
Igual ao tampão anterior coma diferença de possuir NaCl
 Tris-HCl
 MgCl2
 EDTA
 KCl
 NaCl
- Prepara a amostra para o passo 13 (adição de NaCl saturado).

Tampão TKM X-100
 2,5% de Triton X-100 em tampão TKM-1
- Triton é um detergente
- Permite a lise das células para extracção de DNA

Tampão TE
Tampão de conservação
 Tris-HCl
- Tampão que mantém pH estável.

 EDTA
- Inactiva actividade dasnucleases
- Agente quelante que se liga a iões que são cofactores das nucleases
- Anticoagulante do tipo não heparínico que inibe reacções enzimáticas
 Características do TE
- Conserva durante longos tempos;
- Se amostra não estiver pura  Conservar a -20ºC, no entanto o congelamento vai quebrar DNA;
- Se amostra estiver pura  Conservar a 4ºC

Igepal (Sigma)
 Detergente não iónico
 Provocaa lise celular das células

SDS a 10%
 Detergente iónico
 Desnatura e dissocia proteínas nucleares

NaCl saturado
 Separa as proteínas dos restantes constituintes

Etanol absoluto (-20ºC)
 Precipita o DNA

Protocolo Experimental
1)

Colher o sangue em tubos com anticoagulante EDTA;
- EDTA: Antiacoagulante não heparínico que inibe as reacções enzimáticas

2) Adicionar otampão TKM X-100;
- Contém detergente que usa as células para extrair o DNA;
3) Adicionar o Igepal e misturar através da inversão e centrifugação;
- Detergente não iónico que provoca a lise das células
4) Adicionar ao pellet Tampão TKM-1 e centrifugar;
- Função de: Manter pH estável, protecção do DNA e inibir actividade das nucleases
5) Retirar o sobrenadante e adicionar ao pellet tampão TKM-2
-Função de: Manter pH estável, protecção do DNA, inibir actividade das nucleases e preparar amostra;
6) Adição de SDS a 10%;
- Desnatura as proteínas
7) Adição de NaCl saturado
- Separar as proteínas dos restantes constituintes
8) Centrifugar e remover sobrenadante que tem DNA;
9) Adicionar etanol absoluto;
- Para precipitar DNA
10) Adição de tampão TE;

- Para conservar DNA e inactivaractividade das nucleases.
11) Retirar DNA com ponta, secar e colocar num tubo com tampão TE e conservando a 4ºC.

Resumindo

Adição de
Igepal

Adição de
TKM-1

Adição de
TKM-2

Adição de
SDS

Adição de
NaCl
saturado

Conservar
a 4ºC

Adição de
TKM X-100

Adição de
TE

Adição de
Etanol
absoluto

Formas de separar as proteínas
 Através de solventes orgânicos (Casode Biologia molecular Clorofórmio-Fenol);
 Concentração saturada de NaCl.

Se fosse preciso purificar DNA
 Utilização da RNAse que removeria o RNA presente em maior quantidade;

Secagem do DNA
A mais:
 Normalmente acontece quando DNA é posto em estufa;
 Se isto acontecer, quando se transfere para uma solução aquosa não é possível ressuspender;
A menos:
 Álcool fica no DNA;
Interfere com acção das enzimas e na concentração.

Outras considerações da professora
 Actividade dos detergentes é mais eficaz quando utilizados a quente.

Aula nº2 – Análise espectrofotométrica do DNA: Quantificação e determinação do grau de pureza do DNA

Objectivo
 Quantificar e determinar o grau de pureza do DNA pelo método de espectroscopia UV -VIS.

Método Espectrofotométrico...
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