Bioq

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA – SDS (SDS-PAGE)

A eletroforese é uma técnica analítica que separa moléculas por carga e tamanho. Na eletroforese de proteínas utiliza-se o gel de poliacrilamida, o qual é formado pela co-polimerização de acrilamida e bisacrilamida, constituindo-se em uma rede porosa, cujo diâmetro dos poros é inversamente proporcional a concentração de acrilamida. Quando deseja-se separar as proteínas somente por tamanho, utiliza-se a técnica de SDS-PAGE (SDSPolyacrylamide Gel Electrophoresis). O SDS é um detergente aniônico forte, que se liga aos resíduos positivamente carregados das proteínas, conferindo às mesmas uma carga final negativa e ocasionando a desnaturação. Outro agente que auxilia na desnaturação proteica é o β-mercaptoetanol, que promove a redução das ligações dissulfeto entre os resíduos de cisteína. Desta forma, todas as proteínas da amostra possuirão carga negativa, estarão linearizadas, e migrarão em direção ao eletrodo positivamente carregado. A velocidade de migração dependerá somente da massa molecular, sendo que proteínas com menor tamanho passarão mais facilmente através da malha do gel e, portanto, migrarão a uma distância maior.

O gel de poliacrilamida é formado por duas partes. O gel de empilhamento, com menor concentração de poliacrilamida e poros grandes que permitem a migração igualitária das proteínas, independente das massas moleculares, levando-as a empilharem-se em uma faixa estreita. Após o empilhamento, as proteínas entram no gel de separação, cujos poros são menores, e a velocidade de migração passa a ser dependente das massas moleculares.

A tabela abaixo apresenta a relação entre a concentração de acrilamida e a faixa de separação das proteínas em KDa.

A. Preparo do gel de poliacrilamida

O gel de separação foi adicionado entre as placas do aparato e, para retirar bolhas, 100 µL de água destilada foram adicionados sobre o gel. Após a polimerização, a água foi retirada e a superfície do gel de