Técnica de PCR

Reação em Cadeia de Polimerase

Relembrando...
• Características Estruturais
5´

3´

3´

5´

Relembrando...
• Bases da Biologia Molecular

DNA

Replicação

Transcrição

RNA

Tradução

Proteína

Relembrando...

• Replicação do DNA in vivo

Extremidade 3’-OH

DNA polimerase

Primers

Dr. Arthur Kornberg
Dr. Har Gobind Khorana

1956 – Isolamento da DNA polimerase I
- replicação da molécula de DNA in vitro.

Nobel em 1959

Princípio: replicação de um pedaço de DNA utilizando 2 primers.

Nobel em 1971

1985 Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Artigo recusado
Nature e Science

1993 – Nobel de Química
Dr. Kary Mullis

“Amplificação de regiões genômicas específicas. Gera um produto que pode ser visualizado diretamente na escala visual humana.”

PCR
Vantagens
Grande quantidade de DNA em pouco tempo;
Baixo Custo;
As amostras de DNA não necessitam ser altamente purificadas;
Pode amplificar um única molécula de DNA;
O produto de PCR (amplicon) pode ser posteriormente manipulado (tratado com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado). Desvantagem
Conhecimento prévio das regiões que flanqueiam a sequência alvo. Reagentes
Enzima – uma DNA polimerase termoestável que sintetize duas novas fitas complementares à sequência alvo;
Quatro dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatados) – A, G, C e T;
DNA molde – contendo a sequência alvo da PCR;
Dois primers sintéticos – proporcionam os sítios de iniciação para copiar a sequência alvo;
Tampão e sais – proporcionam o pH ideal e a formação iônica para a atividade da enzima e da especificidade de hibridização ao DNA;
Cátion metal divalente – íon magnésio ou manganês (cofator enzimático) para “conduzir” a enzima.

Etapas

Preparo da Reação

Amplificação em Termociclador

Visualização dos Fragmentos Resultantes por Eletroforese

Preparo da Reação
Reação Padrão – produção de 2 a 4 µg DNA (3h)