TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR DNA RECOMBINANTE

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Extracao de DNA
Fenol (Desnaturacao das proteinas) / coloroformio (retira residuos de fenol) /alcool isoamilico (reduz espuma)
Lise celular auxiliada mecanicamente
Precipitacao do RNA com alcool isopropilico
Ressuspensao do RNA
Analise do RNA extraido
Qualidade da estração: visualizacao em gel de agarose com brometo de etidio.
Na eletroforese: 28S, 18S, 5S.
Eletroforese
Reação em Cadeia da Polimerase
Isolar e amplificar o DNA.
Aplicações: 1) sequenciamento de genomas 2) expressao de genes em sistema recombinante 3) estudo de biologia molecular 4) teste de dna 5) estudo de doencas infecciosas.
PCR em tempo real (analise qualitativa - ausencia ou presence de um gene - ou quantitative – qtde de um gene). Quantitativo (carga viral,expressao genica, transgenicos). Qualitativo (SNPs, patógenos). Monitoramento da reacao; deteccao do produto a medida em que esta sendo formado.
- Primer.
Sybr Green.
Sistemas de Detecção: Sondas
(R: reporter / Q: quencher). Florocromo >> Fluorescencia.
Hibridização.
Tipagem de individuo, teste de paternidade, identificação de criminoso, descoberta de novos genes.
Sequenciamento Genético.
Método de Sanger: consiste em identificar continuamente e sequencialmente, ultimo nucleotídeo incorporado na cadeia.
DNA Polimerase so trabalha no sentido 5’> 3’.
Adiciona desoxirribonucleosideo trifosfatado.
No terminal livre de 3’OH >> sequencia pre existente (primer).
Os ddNTPs são terminadores (não possuem 3’OH livre).
Não perpetuam o ataque nucleofilico sobre o fostato.
Ao final há uma eletroforecs e pode se identificar o próximo nucleotídeo
Microarray / Chip de DNA
Pode-se avaliar vários genes ao mesmo tempo.
Mapear mutações, detecção de expressão de oncogenes, vias metabólicas, genes anônimos, analisar 10k amostras em 12h.
RNA de interferência
Tecnica de silenciamento gênico por RNAi.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
1 – Extração e purificação do Dna de interesse
2 - Amplificação do dna de interesse por PCR
3 - Cortando