Pratica Lactase

Aula Prática: Produção de lactase por Kluyveromyces marxianus

Micro-organismo

O micro-organismo utilizado será a Kluyveromyces marxianus obtido da Centraal bureau voor Schimmelcultures sob o código CBS 6556. Para manutenção da cepa é empregado o cultivo em placas de Petri com o meio YPL sólido (extrato de levedura 2%, peptona 1%, lactose 2%, Agar 1,5%) com repiques mensais e mantidos em refrigerador a 4ºC.

Condições de cultivo

A cepa será ativada inoculando 4 alçadas da levedura cultivada em placas de Petri em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio. O frasco será incubado “overnight”, a 37ºC e 120 min-1. A cultura resultante será utilizada como inóculo para os experimentos.

Os experimentos serão conduzidos à temperatura de 37ºC, em frascos de Erlenmeyer não aletados (500mL), contendo 200 mL de meio YPL (extrato de levedura, peptona e lactose), com agitação de 120 min-1 por aproximadamente 24 horas. A taxa de inoculação será de 9,1% (200 mL de meio + 20 mL de inóculo).

As amostras serão retiradas nos tempos previstos na Tabela em anexo e as seguintes análises serão efetuadas:

Determinação da biomassa
A biomassa será medida por turbidimetria. Leituras de absorbância das suspensões de células, diluídas ou não, provenientes das fermentações serão realizadas em um espectrofotômetro, medindo-se a absorbância a 600 nm e convertidas em concentração celular (g.L-1) por meio de uma curva de calibração.
Para a construção da curva de calibração, as células de Kluyveromyces marxianus CBS 6556 foram cultivadas em meio YPL. Após atingir uma densidade óptica de aproximadamente 1, a suspensão sofreu várias diluições. Uma curva foi construída correlacionando a absorbância com a concentração celular (g.L-1), conforme a Equação 1.

ABS = 1,1752 X – 0,1496 Eq. 1

Determinação do consumo de lactose

A concentração de lactose no meio será obtida pelo método do DNS, conforme descrito em anexo.

Atividade enzimática:

Rompimento celular
2,0 mL de amostra