Extração do RNA

Dweyme de Freitas

Extração do RNA

Preparação:
1. Configure centrifugar a 4 oC
2. No laboratório RNA, garantir que todas as superfícies e pipetas são tratados com RNAseZAP , e só usar RNase equipamentos livre / luvas

Separação de fases : [do protocolo reagente Invitrogen TRIzole ]

1. Incubar as amostras homogeneizadas durante 5 minutos a 15 a 30 ° C para permitir a dissociação completa de complexos nucleoproteicos .
2. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio por cada 1 ml de Reagente de TRIZOL .
3. Cap tubos de amostra de forma segura . Agitar tubos vigorosamente à mão durante 15 segundos e incubar a 15 a 30 ° C durante 2 a 3 minutos .
4. Centrifugue as amostras a não mais do que 12.000 × g durante 15 minutos a 2 a 8 ° C .
5. Após a centrifugação , a mistura separa-se em , uma fase inferior de vermelho de fenol - clorofórmio , uma interfase , e uma fase aquosa superior incolor . RNA permanece exclusivamente na fase aquosa . O volume da fase aquosa é de cerca de 60 % do volume do reagente TRIZOL usado para a homogeneização.

A ligação para a coluna e limpeza : [ Qiagen RNeasy Células Animais protocolo rotação]

6. Remova o sobrenadante claro em tubo Eppendorf limpo e adicionar um volume de 70 % de etanol para lisado homogeneizado. Misture bem por pippetting . Não centrifugar / vórtice.

7. Transferência de até 700 ul de amostra a coluna de centrifugação RNeasy colocada num tubo de recolha de 2 ml . Fechar a tampa firmemente e centrifugar durante 1 min a 10000 rpm para lavar coluna de centrifugação . Descarte fluir. Repita se mais solução RNA está disponível .

Digestão na coluna DNase com a RNase conjunto DNase livre : [ Qiagen ]

8. Adicione 350 mL de tampão RW1 para RNeasy coluna de rotação . Fechar a tampa firmemente e centrifugar durante 1 min a 10000 rpm para lavar coluna de centrifugação . Descarte fluir.
9. Adicionar 10 ml de solução estoque DNaseI a 70 mL de buffer RDD por amostra. Misturar suavemente por inversão do tubo ,