A fosfatidilserina na membrana regula a carga da superfície e a localização de proteínas

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  • Publicado : 18 de março de 2013
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A fosfatidilserina na membrana regula a carga da superfície e a localização de proteínas
Tony Yeung, et al.

Introdução teórica

A carga negativa da superfície do folheto interno da membrana plasmática determina a localização de proteínas com cargas policatiónicas. A negatividade única do folheto interno da membrana plasmática tem sido atribuída, em parte, ao seu conteúdopolifosfoinositídico. Apesar de serem polivalentes, os polifosfoinositídeos representam apenas uma pequena fracção dos fosfolípidos presentes na membrana plasmática e são menos abundantes que a fosfatidilserina (PS) a espécie aniónica predominante. O contributo da PS para a localização e retenção de proteínas catiónicas é incerta devido à falta de sondas adequadas para monitorizar a distribuição de PS em célulasvivas.

Procedimento e Resultados

Por isso, os cientistas desenvolveram uma sonda para monitorizar esta distribuição. A lactaderina, uma glicoproteína do leite, liga a PS, numa forma independente de cálcio, com o seu domínio C2. O domínio C2 da lactaderina (Lact-C2) foi utilizado para gerar biosensores fluorescentes. A Lact-C2 recombinante foi gerada em bactérias e purificada para testar a suaafinidade com lipossomas contendo PS, através de transferências de energia por ressonância de fluorescência. Revestiram microesferas de vidro com bicamadas fosfolipídicas que continham 20% de PS e 80% de PC (liposferas). Aqui comprovaram que os lipossomas (de composições variadas) são eficazes na deslocação do Lact-C2 presente nestas microesferas. Os lipossomas que continham 5 a 20% de PS reduzirama Lact-C2 ligada às liposferas de uma forma proporcional à concentração, enquanto que os lipossomas que contém apenas PC ou níveis fisiológicos de fosfoinisitídeos (PI) não tiveram efeito.
A Lact-C2 fundida à proteína fluorescente verde (GFP – Lact-C2) liga-se exclusivamente a grânulos revestidos de PS, mas não aos revestidos de PC ou outros tipos de fosfolípidos aniónicos. Estes dados confirmammais uma vez a selectividade observada com o domínio C2.
Depois, expressou-se GFP – Lact-C2 em tipos de Saccharomyces cerevisiae selvagem e mutante (deficiente em PS). Este observou-se predominantemente na membrana plasmática da levedura de tipo selvagem; contudo, no tipo mutante, foi observado no citoplasma. Estas descobertas demonstraram que a maioria das ligações membranares de Lact-C2requerem PS.
Várias linhas de evidência indicam que a ligação membranar da GFP – Lact-C2 foi da responsabilidade da PS e não da carga negativa da membrana. Primeiro, mesmo depois da eliminação de PI, a Lact-C2 continuou ligada à membrana. Depois, a diminuição de negatividade da membrana plasmática não teve qualquer efeito na GFP – Lact-C2, mas induziu uma redistribuição drástica dos indicadores decarga de superfície.
A seguir, identificaram-se os organelos endomembranares possuidores de PS na sua superfície citosólica por análise de colocalização. As mitocôndrias, o complexo de Golgi e o retículo endoplasmático não colocalizaram significantemente com a Lact-C2. Estas descobertas foram inesperadas porque a PS é sintetizada, transportada ou metabolizada nestes compartimentos. Váriossubcompartimentos da via endocítica foram rotulados com Lact-C2: endossomas precoces, endossomas maduros e lisossomas foram todos colocalizados com a sonda de PS.
A presença de PS pode conferir carga negativa à superfície de endossomas e lisossomas. Para testar esta hipótese, expressou-se uma série de biosensores de carga de superfície. Os biosensores mais catiónicos, que são esperados que se acumulem emmembranas com carga de superfície mais negativa, localizaram-se preferencialmente na membrana plasmática, o que suporta a noção de que esta membrana possui grande negatividade na sua superfície interna, provavelmente devido à acumulação única de fosfoinositídeos.

Discussão

Um aumento progressivo no número de cargas positivas deveria favorecer a interacção dos biosensores com membranas...
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