Sequencimaneto

APOSTILA DE
SEQUENCIAMENTO DE DNA

Lilian Giotto Zaros
Nirlei Aparecida Silva
Kerli Ninov

Fevereiro de 2008
SEQUENCIAMENTO - KIT AMERSHAM (GE)
Lilian Giotto Zaros

Nirlei Aparecida Silva
Kerli Ninov

INTRODUÇÃO
As duas técnicas mais importantes para o sequenciamento de DNA são o método químico de degradação de bases desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert em 1977 e o método didesoxi ou terminação da cadeia de Fred Sanger e colaboradores em 1978.
Os dois métodos são baseados na produção de um conjunto de fitas simples de DNA que são separadas pelo princípio de eletroforese (Okubo et al., 1992).Se comparado ao sequenciamento de
Maxam e Gilbert, o método de terminação da cadeia de Sanger gera dados que são mais facilmente interpretados. Por isso, essa tem sido a técnica mais utilizada em Projetos Genoma (Sterky &
Lundeberg, 2000).

SEQUENCIAMENTO DIDESOXI OU POR TERMINAÇÃO DA CADEIA
É baseado na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos
(ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como molde o DNA de interesse.
Quando os ddNTPs são adicionados, a extensão da cadeia é interrompida pois esses didesoxinucleotídeos não apresentam um grupo hidroxila (OH) 3’ necessário para a ligação do próximo desoxinucleotídeo (dNTP). Como esses ddNTPs são marcados, podem ser detectados e a seqüência dos nucleotídeos identificada.
Esse método apresenta duas modalidades:

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Sequenciamento Manual

No método manual, a sequência de bases do DNA é lida manualmente, após a exposição das bases identificadas em um filme de raio-X. Para isso são preparados 4 tubos de reação, cada um contendo o DNA molde, a DNA polimerase e um primer. Cada tubo recebe uma pequena quantidade de ddNTP (dATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP) junto com um dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP ou dGTP) marcados com fósforo radioativo (P32).
Em qualquer um dos 4 tubos serão produzidos vários comprimentos de cadeia, cada um correspondente ao ponto no qual o