Pcr em tempo real

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PCR em Tempo Real

Dr Robson Francisco Carvalho
rfcarvalho@ibb.unesp.br

Departamento de Morfologia

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

1

PCR em Tempo Real
O que há de errado comos géis de agarose?
* Pobre precisão * Baixa sensitividade * Curta extensão dinâmica (< 2 logs) * Baixa resolução * Não automatizado

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real
O que há de errado comos géis de agarose?
* Resultados não são expressos em números * Colorações não são muito quantitativas * Pós-processamento do produto da PCR * Contaminação (brometo) * Discriminação baseada apenas notamanho do fragmento

PCR em tempo real

2

PCR em Tempo Real
PCR tradicional x PCR tempo real:
Starting Template PCR Round 1 2X Template

Fluorescence

Cycle Análise Real-time PCRtradicional Deteção do produto no gel de agarose Constante detecção e monitoramento dos produtos de amplificação durante toda corrida

PCR Round 2

4X Template

(emissão de fluorescência)

30-40ciclos
PCR em tempo real

Sistemas de detecção
PCR em tempo real:
→ Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente

PCR em tempo real

3

PCR em Tempo Real
Vantagens doPCR em tempo real:

→ Não é influenciado por amplificação não-específica (sondas) → Amplificação pode ser monitorada em tempo real → Ciclos mais rápidos → Detecção de alteração menor que 2x 5x Gelde agarose

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real
Vantagens do PCR em tempo real:

→ Maior extensão dinâmica (de até 1010 x) → Requer 1000x menos DNA que demais ensaios (3 picogramas = 1 genoma)→ confirmação da amplificação específica (análise da curva de melting) → MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL → Não é muito mais caro que a PCR convencional (exceção: preço do equipamento)
PCRem tempo real

4

PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:

→ Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação ~100%). Reação específica e precisa. → Linear: Alta...
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