Microscopia

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BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I
Métodos instrumentais de análise para o estudo
de células e tecidos - Microscopia
Objectivos:
◉ Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula
◉ Definir e analisar a metodologia usada na:
-Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de
fluorescência;
-Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; Microscopia Electrónica de Transmissão ede Varrimento.
◉ Listar e descrever a preparação do material biológico para a
microscopia óptica e electrónica

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Poder de
resolução

Microscopia depende de:
- técnicas de preparação
das amostras biológicas
- poder de resolução dos
microscópios

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
história da microscopia1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto

1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1ªx uma bactéria
1879 - Flemming descreve o comportamento dos
cromossomas na mitose de cél animais.
1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem técnicas de
coloração e lançaram os fundamentos da anatomia
microscópia
1882 a 1899 – Klebs e Pasteur utilizando variados corantes
identificamimportantes agentes patogénicos.
1886 – Zeiss constroi uma série de lentes q permite revelar
estruturas nos limites teóricos da luz visível

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
histó
história da microscopia
1898 – Golgi descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois
da coloração das células com nitrato de prata
1932 – Zernicke inventa o microscópio decontraste de fase
Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam
vistas em detalhe pela 1ª vez
1981 – Allen e Inoué – aperfeiçoam o microscópio óptico
de contraste com sistema de vídeo avançado
1988 – Microscópios confocais de varredura comerciais
passam a ser amplamente utilizados

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
O limite máximo deresolução de 1 microscópio óptico
é determinado pelo comprimento de onda da luz
visível, q varia de 0,4 µm (violeta) a 0,7 µm
(vermelho).

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA

Detalhes revelados pelo microscópio óptico
Limite de resolução – é o limite de separação pelo qual
2 objectos podem ser distinguidos.

Limite de resolução depende de:
- comprimento de onda da luz (λ)
-abertura numérica do sistema de lentes (an)

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico

A abertura numérica – é a capacidade do
sistema de lentes recolher a luz.
- lentes secas - an não pode ser maior que 1
- lentes de imersão – an pode chegar a 1,4
Qto > a an > a resolução e > a luminosidade.

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação domaterial biológico para a microscopia óptica Fixação

A fixação

imobiliza,
mata e
preserva e endurece as células.
torna-as permeáveis aos corantes e
produz uma ligação cruzada entre as suas
macromoléculas, permitindo que estas
permaneçam estabilizadas nas suas posições
naturais

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica FixaçãoProcedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicos
como o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴ usados em
combinações.
Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído)
que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das
proteínas produzindo ligações cruzadas.
Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura
da célula ou das suas moléculas ∴ umaalternativa é o
congelamento rápido.
Vantagens- proteínas bem preservadas
Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais
de gelo
O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomo
mantido numa câmara a ↓ T)

COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Embebição

Mesmo após a fixação os tecidos são macios...
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