Km invertase

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UNIVERSIDADE FEDEREAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE TOXICOLOGIA ANALÍTICA BIOQUÍMICA – Professora Jenifer Saffi INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO KM da invertase OBJETIVOS Esta prática tinha como objetivos a visualização e reconher a concentração de substrato como um dos fatores que alteram a atividade enzimática. Identificar a fase ascendente e a fase de platô na curva de velocidade(V) versus concentração de substrato [S], assim como determinar e compreender o significado da Constante de MichaelisMentem (KM). IDENTIFICAÇÃO Nome: Dines Audrei Araujo de Oliveira. INTRODUÇÃO A atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada, ou seja, pela quantidade de produto fornado ou quantidade de substrato transformado, por unidade de tempo. Sabe-se que avelocidade de uma reação enzimática é proporcional à concentração do complexo enzima-substrato (ES) formando. E + S ⇌ ES ⇌ E + P Existem fatores que influenciam na formação do complexo ES, como a concentração do substrato e a concentração de enzima. Para uma determinada concentração de enzima, o aumento da concentração de substrato causa um aumento gradual na velocidade de reação catalisada, sendosignificante para concentrações baixas de substrato. Entretando, observa-se que a velocidade (V) aumenta até atingir um patamar, um platô, no qual a velocidade se modifica muito pouco, mesmo com as adições de substrato. Esta situação é considerada como velocidade máxima da reação (Vmáx), sendo uma situação em que todas as enzimas estão complexadas com seu substrato. Este comportamento é observado portodas as enzimas. Michaelis e Menten estudaram o fenômeno de saturação da enzima pelo substrato e elaboraram a seguinte equação: Curso: Toxicologia Analítica - turma: B

Onde, V = velocidade da reação; Vmáx = velocidade máxima da reação; KM = constante de Michaelis-Menten; [S] = concentração de substrato. Por dedução matemática, tem-se que quando a velocidade da reação for igual à metade davelocidade máxima:

Logo, a constante de Michaelis-Menten é igual à concentração de substrato, quando a velocidade da catalise for igual à metade da velovidade máxima, sendo que esta constante relaciona a afinidade da enzima com o substrato, para a formação de ES. Quando maior for KM, menor será a afinidade, e vice-versa. Figura 1: Gráfico Michaelis-Menten

(Fonte: BIANCONI, M. Lucia. Efeito daConcentração de Substrato na Atividade Enzimática.) Contudo, não é possível determinar o Vmáx ou KM com muita precisão a partir do gráfico de Michaelis-Menten. A equação de Lineweaver-Burk foi obtida a partir da inversão da equação citada anteriormente, e com ela é possível então, obter-se valores mais exatos de Vmáx e KM, pois é uma equação linear:

Onde,

= inverso da velocidade, sendo y; =inverso da concentração de substrato, sendo x; = inclinação da reta, sendo a; = ponto de interseção da Vmáx em y, sendo b. Figura 2: Gráfico Lineweaver-Burk

(Fonte: BIANCONI, M. Lucia. Efeito da Concentração de Substrato na Atividade Enzimática.)

A atividade enzimática pode ser determinada pela medida espectrofotométrica direta da absorção da luz pelo grupo prostético. A absormetria é ummétodo quantitativo baseado na capacidade de absorção de energia eletromagnética apresentada por moléculas. Utilizando-se soluções coloridas, onde a intensidade da cor produzida for proporcional à quantidade de soluto contido, pode-se determinar a quantidade desta substância, a partir de soluções cujas concentrações sejam conhecidas (padrões). Figura 3: Componentes de um Espectrofotômetro

(Fonte:SANTOS, Luiz Ricardo dos. Espectrofotometria.) A invertase é uma enzima que catalisa a reação de hidrolase da sacarose, portante, trata-se de uma hidrolase, produzindo uma mistura equimolar de glicose e frutose. Esta mistura é conhecida como açúcar invertido, que é muito utilizado nas indústrias alimentícias, por apresentar um alto poder adocicante. Figura 4: Hidrólise da Sacarose pela Invertase...
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