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P10. Isolamento, quantificação e análise de proteínas




Introdução




Existem vários métodos para a quantificação de proteínas, nomeadamente o método por nihidrina, método doBiureto, método "Bradford", método "BCA" e o método "Lowry". O método de determinação da concentração total de proteína descrito por Lowry et al. (1951) foi o escolhido para esta aula prática, devido aofacto da sua sensibilidade para baixas concentrações proteicas, em relação ao método do biureto e à leitura simples da absorvância a um comprimento de onda (λ) de 280 nm.


Em geral, os métodos dedeterminação de concentração de proteínas baseiam-se em métodos colorimétricos, ou seja, a concentração de proteína é estimada através da leitura espectrofotométrica de um produto corado. Porexemplo, o método "Bradford" baseia-se no facto de, em condições acídicas, o pico de absorção do azul de Coomassie G-250 passar de λ=465 nm para λ=595 nm quando este corante se liga tanto a grupos hidrófoboscomo iónicos dos resíduos de aminoácidos das cadeias polipeptídicas. Por seu lado, o método "BCA" baseia-se no facto de, em condições alcalinas, o Cu(II) ser reduzido a Cu(I) em presença das cadeiaspolipeptídicas e de ácido bicinconínico (BCA, de bicinchoninic acid). O método do biureto corresponde à reacção das ligações peptídicas com o ião Cu2+ em condições alcalinas. Lowry et al. (1951)melhoram este último método, adicionando uma segunda reacção: a reacção do reagente de Folin-Ciocalteau, o qual contém na sua composição ácido molibdato-tungsténico. Este complexo iónico é reduzido pelascadeias polipeptídicas contendo resíduos de triptofano e tirosina, dando lugar à formação de um produto corado e cuja concentração pode ser estimada espectrofotometricamente a λ=750 nm. No entanto, énecessário ter em atenção que determinados compostos como seja o EDTA, sulfato de amónio, Triton-X-100, compostos ricos em grupos -SH e fenólicos podem interferir com esta última reacção.

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