Espectrofotometria UFPR

Roteiro de Aula Prática - Espectrofotometria
1. Introdução:
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analítico através do qual se identifica e determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz). A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas. Utiliza-se comumente o comprimento de onda ultravioleta (280 nm) para a identificação de proteínas em materiais biológicos. Contudo outras metodologias, reação do “Biureto”, podem ser utilizadas

para a caracterização de proteínas de maneira quantificativa. O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as proteínas formam um complexo com o íon cúprico (Cu++) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção. A reação é positiva para peptídeos constituídos de no mínimo 3 (três) aminoácidos. R

O
... C

O

R

C C C ...
NH H NH H

cor violeta Cu2+

NH H NH H
C C
C ...
R O R
O

... C

2. Objetivos:
 Identificar e quantificar o teor de algumas substâncias
3. Material e Métodos
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
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Espectrofotômetro com cubetas
1 Pipetas de 5 mL graduadas;
2 Pipetas de 10 mL graduadas;
Estante com 7 tubos de ensaio;
Reagente do Biureto;

4. Procedimento

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Hidróxido de sódio (NaOH)
Caseína
Albumina
Clara de ovo.

Tabela 1
 (nM)

1ª ETAPA
A) Coleta de dados para a construção do espectro de absorção da solução (2,0 mL de água, 2,0 mL de padrão e 2,0 mL de reagente do Biureto, 3 gotas de hidróxido de sódio
(Agitar e deixar em repouso). Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) da solução, preenchendo os dados da tabela 1.

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