Embriologia

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Capítulo 1

Vera Lúcia da Silva Valente Gaiesky

Ferramentas Metodológicas

1. Tecnologias de DNA recombinante 2
1.1 Hibridização in situ 2 1.2 Reação em cadeia da polimerase 4 1.3 Vetores de clonagem e de expressão 4 1.4 Organismos transgênicos 5 1.5 Outros métodos 9

Embriologia 2

O avanço científico observado nas últimas décadas propiciou que fossem desenvolvidas novas ferramentas(técnicas e métodos) para o estudo da biologia do desenvolvimento, o que permitiu explorar processos e moléculas envolvidos na complexa rede de interações responsável pela regulação gênica do desenvolvimento de embriões. Antes de as técnicas de biologia molecular serem aperfeiçoadas, o embriologista podia apenas observar e descrever o embrião em seus diferentes momentos. Hoje, as novastecnologias permitem ao profissional estabelecer similaridades entre os estágios de vida de organismos até então considerados muito distantes, tendo como base o compartilhamento e a expressão de seus genes. O conhecimento relativo à hierarquia gênica e ao circuito de genes que ligam e desligam a atividade de centenas de outros genes de forma extremamente precisa, bem como a caracterização de seus produtos,a comparação de suas sequências de bases e a sua regulação são exemplos de como a biologia moderna aproximou definitivamente embriologistas, geneticistas, bioquímicos, paleontólogos e evolucionistas para o estudo da Evo-Devo (do inglês Evolutionary development) – que significa desenvolvimento do ponto de vista evolutivo.

bridização de ácidos nucleicos. Essas sequências, aqui consideradas sondas(probes), puderam então ser encontradas em quaisquer genomas, bem como foi possível decifrar a organização dos genes que as portam (como, p. ex., se eles possuem, ou não, os sítios reconhecidos pelas enzimas de restrição em comparação com o genoma dos organismos originais dos quais o DNA foi extraído). O estudo dessas homologias, por hibridização, pode ser realizado tanto anelando-se a sondadesnaturada (com a dupla hélice aberta) com o DNA-alvo extraído, fragmentado pelas endonucleases de restrição e submetido à eletroforese, como com células em suspensão, com cortes de tecidos em lâminas ou com embriões inteiros (whole mount). A visualização da região homologada com a sonda em cromossomos, em tecidos e em órgãos intactos dos embriões é mais difícil do que com a amostra de DNApurificado. Isso ocorre porque, nesses casos, há inúmeros obstáculos à hibridização, representados pelas moléculas envolvidas na organização da cromatina dos tecidos e órgãos para o encontro da sonda com a sequência homóloga a ela. Assim, a hibridização da sonda com o DNA-alvo extraído é mais facilmente estudada por meio da técnica conhecida como Southern blot. Esse método consiste em submeter uma amostrade DNA isolado de um doador, fragmentado com as enzimas de restrição apropriadas para a obtenção de fragmentos de diferentes tamanhos, à separação por eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio (um composto que se intercala na dupla hélice, emite fluorescência e é visualizado sob luz ultravioleta). O gel é fotografado e imerso em uma solução de hidróxido de sódio, quepromoverá a desnaturação dos fragmentos de DNA, os quais serão transferidos por capilaridade para um pedaço de membrana de náilon ou de nitrocelulose. A sonda a ser utilizada será marcada radiativamente, ou não, e hibridizada com o DNA desnaturado transferido para a membrana. Após serem fornecidas as condições e o tempo para que a sonda encontre a sequência de bases complementar a ela no DNA hospedeiro,essa membrana é lavada, a fim de eliminar o excesso da sonda que não se ligou ao DNA. O rigor com que essa membrana é lavada, para eliminar mais ou menos sequências com diferentes graus de homologia do DNA-teste com a sonda, é chamado estringência. Se a sonda for marcada radiativamente ou com compostos que emitem luz, o padrão de hibridização na membrana será revelado por autorradiografia (Figura...
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