Trabalho AVA

Páginas: 5 (1197 palavras) Publicado: 22 de outubro de 2013
Principio do PCR (Polymerase chain reaction ou Reação da polimerase em cadeia):
Principio da PCR (Polymerase chain reaction ou Reação da polimerase em cadeia):
O principal propósito da PCR é fazer um número imenso de copias de um determinado fragmento gênico, ao qual o tamanho pode variar de poucos pb (pares de bases) até milhares de pb. A técnica explora função natural da enzimachamada de taq – polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, esta enzima é semelhante à enzima DNA – polimerase que é capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5’ Þ 3’. Para catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presente sob a forma de desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP).
Para utilizar esta técnica é necessário ter umconhecimento prévio da seqüência dos genes a serem amplificados, e a partir disso são sintetizados dois primers ou iniciadores, ou seja, é a partir deles que se inicia a síntese do DNA pela enzima taq – polimerase. A síntese se desenvolve sempre no sentido 5’ Þ 3’.
Ciclos da PCR:
Fase de desnaturação (94 -96°C): fase onde ocorre o desenrolamento da fita dupla do DNA através da quebradas pontes de hidrogênio entre as bases pareáveis (A – T, G – C), dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrer.
Fase de hibridização ou anelamento (50-54°C): nesta fase os “primers” se ligam, especificamente, às suas seqüências homologas correspondentes no DNA.
Fase de extensão do DNA (72-76°C): fase onde ocorre a síntese de umanova fita antiparalela sobre a fita anteriormente desnaturada, a enzima taq – polimerase catalisa esta reação.
Para se ter uma idéia do poder da PCR, após 30 ciclos (numero de ciclos utilizados para a maioria das reações) um único fragmento gênico apresentará mais de 1.000.000.000 de copias.
Reações de PCR mais comuns:
RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): O primeiropasso da reação consiste na síntese de
uma fita de cDNA (DNA complementar) utilizando como molde uma fita de RNA, reação que é catalisada por uma transcriptase reversa. Os primers são inespecíficos e nunca aos pares, sendo oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são hibridizados às regiões Poly-A ou A-Rich do RNA (ricas em adeninas). Após este ciclo, obtém-se ocDNA que será utilizado na PCR.
Multiplex PCR: Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômico devem ser analisados.
Nested PCR: Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico éamplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto, segue-se à amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.
Real time PCR: PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, poréma detecção do resultado e feita a longo dos ciclos. Para que isso ocorra uma molécula conhecida como SYBR green ou um oligonucleotídeo marcado com reporter e quencher é adicionado na reação e conforme a amplificação ocorre ao final de cada ciclo é emitido um sinal fluorescente que é captado por um sistema óptico e convertido em um gráfico de amplificação. Através desta técnica níveis mais altosde sensibilidade são atingidos e o risco de contaminação se torna menor.
PCR-RFLP: submete-se o material amplificado de uma reação de PCR a enzimas digestivas (endonucleases de restrição) que cortam o DNA em posições constantes dentro de um sitio, desta forma o perfil de restrição de um único gene conhecido possa ser comparado com o perfil de outra cepas ou sorogrupos bacterianos....
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