tecnologias de manupulação do DNA

Páginas: 7 (1610 palavras) Publicado: 17 de setembro de 2014
MANIPULAÇÃO DO DNA Biotecnologia
• Atualmente, uma série de novas técnicas permite ao pesquisador a análise detalhada da estrutura molecular do DNA e, por conseqüência, do material genético de um ser vivo.• Esta análise permite, por sua vez, o isolamento e a amplificação de um segmento de DNA, o seu seqüenciamento, identificação e manipulação. • O Projeto Genoma, por exemplo, pretende, atravésdestas técnicas, identificar toda a seqüência de cerca de 3 bilhões de pares de bases do genoma humano - 50.000 a 100.000 genes!!
• Esta abordagem permitirá a identificação de genes relacionados a doenças genéticas específicas, a abre a possibilidade de diagnóstico e até tratamento estas doenças a nível molecular.
Sequenciamento do DNA: Duas técnicas, surgidas no final dos anos 70, são empregadaspara o seqüenciamento de fragmentos de nucleotídeos:• Método Químico ou de Maxam-Gilbert Método Enzimático ou de Singer Em ambos os casos, é possível se definir com precisão a seqüência exata de nucleotídeos de um segmento de DNA.• Amplificação de um Segmento de DNA: O enorme tamanho e a imensa variabilidade da molécula do DNA são os principais obstáculos ao isolamento e sequenciamento de genes.• Assim, técnicas especiais são necessárias para a seleção e amplificação de partes da molécula do DNA, gerando fragmentos menores e mais facilmente analisáveis.• São duas as metodologias empregadas atualmente:
A Reação em Cadeia da Polimerase - "Polimerase Chain Reaction", ou PCR. A Clonagem de Genes• Este método - mais recente - de isolamento e amplificação de um segmento de DNA - envolve aprodução "in vitro" de milhões de cópias do segmento em estudo.• O processo exige a utilização de "primers" que isolam o segmento a ser amplificado, da enzima DNA Polimerase, e ocorre em 3 etapas:
• A desnaturação da dupla fita do DNA, em alta temperatura - 90oC O pareamento dos "primers", a baixa temperatura - 37o C A duplicação do segmento isolado através da reação da DNA polimerase.• O processoé cíclico e pode ser repetido "n" vezes, dependendo do grau de amplificação que se deseja.• O "primer" pode ser sintetizado quimicamente, desde que se conheça a seqüência a ser amplificada e a partir desta, e é sempre adicionado em excesso ao meio de reação.
• Se o segmento de DNA a ser amplificado não é conhecido, ele pode ser clonado a um vetor cuja seqüência de DNA adjacente ao recombinanteseja conhecida.• A DNA Polimerase utilizada é termoestável, e isolada do microorganismo Termus aquaticus (Taq Polimerase).• A tecnologia da PCR pode ser empregada nas análises clínicas como um poderoso instrumento de diagnóstico de viroses e infecções bacterianas, como a AIDS e a tuberculose, por exemplo, com enorme ganho em sensibilidade.
• Clonagem de Genes É um método mais complexo de isolamentoe amplificação de DNA que a PCR, mas muito útil em certas situações.• Envolve a utilização de endonucleases de restrição, a criação de mapas de restrição e a utilização de vetores para a recombinação e clonagem do gene em estudo. Em etapas:• As Endonucleases de Restrição fazem a clivagem da molécula do DNA em seqüências específicas da molécula, geralmente palindrômicas.
Exemplo•G A A T T C•C T TA A G
• A Criação do DNA Recombinante envolve a união de um fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-se uma endonuclease de restrição e a DNA ligase.• A clivagem do DNA com a mesma enzima de restrição cria extremidades complementares adesivas que são unidas pela ação da DNA ligase.• Desta forma, um fragmento de DNA pode ser inserido em uma molécula maior, que passa a ser recombinante.•Assim, um determinado gene do genoma humano pode ser inserido no genoma de uma bactéria, por exemplo, e lá ser amplificado ou mesmo transcrito várias vezes.
• Os Vetores: Um vetor é uma molécula de DNA à qual o fragmento de DNA a ser clonado está ligado.• Os principais vetores utilizados são plasmídeos, e vírus de animais.• Os plasmídeos são os mais utilizados para a clonagem de pequenos...
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