Relatorio de PCR

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi desenvolvida por Kary Mullis nos anos 80 e lhe propiciou o prêmio Nobel de Química em 1994. A PCR permite amplificar um gene de cópia única em milhões de cópias, a partir de uma pequena quantidade do DNA original (DNA molde).
O pré-requisito essencial é a determinação da região do gene que será amplificada. Em seguida, são desenhados e sintetizados um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares às regiões flanqueadoras da sequência a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers específicos possuem tamanho entre 17 a 30 nucleotídeos, teor de GC entre 40 a 60% e não são auto-complementares ou complementares entre si.
O processo é composto de três etapas: desnaturação, hibridização (“anelamento”) e extensão, que juntas correspondem a um ciclo da reação. Normalmente são realizados de 25 a 35 ciclos para cada reação na qual a taxa de amplificação é exponencial, 2 nº de ciclos.
1. Desnaturação: a 94 °C, as fitas do DNA são separadas.
2. Hibridização: geralmente entre 45 a 65 °C, os primers hibridizam com suas sequências complementares no DNA molde desnaturado.
3. Extensão: a 72 °C, a DNA Polimerase, na presença íons Mg2+ e dNTPs (desoxinucleotídeos), sintetiza uma nova fita de DNA a partir da extremidade 3’ OH do primer que se encontra hibridizado ao DNA molde. A descoberta da enzima Taq DNA Polimerase, oriunda da bactéria Thermus aquaticus, que vive em fontes hidrotermais, permitiu automatizar o processo utilizando-se os termocicladores. A enzima Taq possui uma atividade ótima a 72 °C, mas permanece estável até 94 °C.
Além da amplificação para clonagem molecular, a técnica de PCR possui outras aplicações como: teste de paternidade, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, medicina forense, testes de organismos transgênicos, análise de polimorfismo de DNA, sequenciamento de DNA e várias aplicações no