Purificação, Caracterização e Engenharia de proteína

Disciplina “Purificação, Caracterização e Engenharia de proteínas”
ICC-FIOCRUZ - Abril 2013
Tema para trabalho de avaliação final:
Considerando um cenário num futuro não muito distante em que todas as proteínas monoméricas e oligoméricas solúveis e interessantes já tenham sido caracterizadas, para propor um novo projeto de pesquisa temos que considerar estudar alguma proteína complexa com as integrinas. Integrinas são proteínas transmembrana com domínios extracelulares que tipicamente formam heterodímeros atuam na adesão celular e na transdução de sinal. Com o propósito de produzir uma integrina de origem humana inteira, recombinante e ativa, defina como poderiam ser abordados os seguintes pontos:
1) - Qual seria o sistema de expressão mais adequado;
O sistema de expressão mais adequado é linhagem de células humanas como por exemplo a linhagem HEK293 (human embryonic kidney 293) comprada da American Type Culture Collection.
2) - Em função do sistema de expressão escolhido, quais as características necessárias para o vetor de expressão e de que forma seria clonada a sequencia codificados das integrinas (verificar estrutura primária das integrinas no NCBI/genbank);
O vetor de expressão deve possuir um sítio específico de restrição para poder clonar o gene de interesse
Para ser clonada a sequência é necessario fazer as sequintes etapas:
a. Crescer as células HEK293 em cultura, depois isolar RNA celular total para poder fazer uma biblioteca de cDNA conforme especificações do fabricante (TRIZOL);
b. Sintetizar o cDNA através da técnica de reação em cadeia pela polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) utilizando primers específicos para a integrina conforme banco de dados do National Center for biotechonology information
c. Ligar ao produto amplificado no item b sequencias que contenham sítio de restrição para posterior clonagem em vetor de expressão.
d. Escolher os plasmideos de expressão que contenham os sítios de restrição homologas