método de braford

Método de Bradford (1976)- Obtenção de curva padrão

Preparação de solução padrão de Albumina (1mg/mL)
Diluir 0,05g de Albumina em 50 ml de Água destilada
Preparar o estoque em balão volumétrico. Aliquotar e guardar no congelador.

Preparação do reagente Comassie Blue G-250
Dissolver 100 mg Comassie Blue em 50 ml de etanol 95% ;
Adicionar 100 ml de ácido fosfórico H3PO4 85% ;
Completar até 1 L com água destilada;
Agitar até dissolver totalmente (overnight);
Filtrar em papel de filtro no dia seguinte;
Manter no escuro (embrulhar a garrafa com papel alumínio)
Obs: Acido Fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol, e nunca o contrario.

Curva Padrão

Todos os tubos, com exceção do 1, são em duplicata.
Numerar tubos de vidro, colocá-los em uma estante e proceder conforme a tabela.
Esperar 5 min e ler em 595 nm, zerando com o tubo 1 e começando pela Curva.
OBS.: Preparar a Curva e as Amostras concomitantemente.
Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alíquotas de 0,1mL retiradas de soluções de 20, 40, 60, 80 e 100 •ug de BSA/0,1mL. Se assim for, a curva seguirá o padrão mostrado na Tabela 2.

Obs : A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) que posteriormente deve ser centrifugado e o pellet ressuspendido com NaOH 0,1N. Após, retirar uma alíquota de 0,1mL e proceder conforme recomendações da curva padrão.

Realizar o cálculo da quantidade de proteína:

1. Fazer a média das absorbâncias obtidas.
2. Calcular o fator da curva de calibração, dividindo a quantidade de albumina no tubo pela absorbância obtida neste tubo
3. Usar o fator da curva de calibração para o cálculo da quantidade de proteína nas amostras (em mg/ ml):
4. [ ] amostras = Abs da amostra x F dividido pelo Volume de amostra utilizado (em ul)

A partir do programa Excel é possível obter um gráfico de curva padrão, como mostrado abaixo: