IQB201 Aula 06 Sequenciamento de Proteinas 03 2011

IQB201 – Bioquímica Básica I

Sequenciamento de Proteínas
Joab Trajano Silva
Instituto de Química/UFRJ

Sequenciamento de Proteínas

A sequencia de aminoácidos de uma proteína pode ser determinada pelo sequenciamento de Edman, a partir da determinação da ordem dos aminoácidos na cadeia peptídica, ou inferida a partir da sequencia de DNA do gene.

Preparo da Proteína para o Sequenciamento

•

Determinar o número e tipos de subunidades presentes na proteína

•

Clivar as pontes de enxofre (se houver)

•

Purificar cada uma das subunidades

•

Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade

•

Determinar o resíduo N-terminal

I. Redução das Pontes Dissulfeto

II. Composição de Aminoácidos da Proteína

II. Composição de Aminoácidos da Proteína

Seal
N2
Protein
6N HCl

e.g. AlaAspSer

110o
24 h

6N HCl
110°, 24h

I ndividual Amino Acids

Ala + Asp + Ser*

+
H 3 N

R 1 O
CH C

R 2
NH

CH

_
COO

H+

+
H 3 N

R 1 O
CH C
+

H

R 2
NH

CH

H

_
COO

O
C

O
H

NH
H+

O
H

H

R 1

H
H3N

CH

COO–

+
R 2
H3N

CH

COO–

•

Completa destruição de Trp

•

Perda parcial de Ser, Thr e Tyr

•

Não destingue Glu de Gln e Asp de Asn
NH 2

O
C
+
H 3 N

O

CH 2

H

O

C

C

N

C

C

N

C

C

R 1

H

O

R 2

Asn
H+

(also hydrolysis of peptide bonds)

Hidrólise Alcalina

B:

H

CH3
C

NH

CH 3

base

C
O

C
NH

H B

H
C

C
O_

L-amino acid

A hidrólise alcalina é realizada em NaOH a 100°C por 4-8h
•Decomposição de Cys, Ser e Thr
•Desaminação e racemização de outros aminoácidos
•Permite a quantificação de Trp

CH 3
NH

+ :B

C
O
D-amino acid

Determinação do Resíduo N-terminal

Análise do N-terminal (Edman)

C-terminal Análise por Carboxipeptidase
H O H H O H
H3N C C N C
CH3

C N

CH2OH

A

H O H

H O H

H O H

H O

C

C

C

C

C N

CH2

C N

CH(CH3)2 H
F

S

C N

CH2CH2SCH3
M

G

V

C O

Carboxypeptidase
H O H H O H
H3N C C N C
CH3

C N

CH2OH

H O H

H O H

H O

C

C

C

C N

CH2

C N

H O

CO

H3N C CO

+

CH(CH3)2 H

CH2CH2SCH3
M

Carboxypeptidase