Imunofluorescencia

Imunofluorescência
Uma técnica comum para detectar-se o corpo de Cajal é a imunofluorescência indireta (IFI) que consiste em ligar-se um anticorpo específico – geralmente de uma espécie diferente da célula - de alguma proteína presente no corpúsculo (como por exemplo a coilina), e depois, inserir outro anticorpo, que seja “anti” o anticorpo utilizado anteriormente, sendo este novo anticorpo de uma terceira espécie e tendo sido também previamente marcado por alguma molécula fluorescente, desta maneira, formam-se complexos antígeno (célula)/anticorpoA/ anticorpoA’, de forma que esta estrutura é bem mais eficiente do que a imunofluorescência direta em que o primeiro e único anticorpo está marcado com a molécula fluorescente, pois a IFI permite que muito mais moléculas fluorescentes se liguem ao antígeno.

Para que a imunofluorescência seja realizada, tais etapas devem ser executadas:

· : Fixação das células com p-formaldeído: lavar as células em PBS gelado, fixar em p-formaldeído 3% por 5 min. à temperatura ambiente; lavar três vezes (5min.) com PBS; colocar em cloreto de amÔnio 50mM por 15 min.; lavar em PBS 1 vez por 5 min. e manter em PBS a 4° até o uso. No dia da reação, permeabilizar em Triton X-100 0,2% por 3 min. a 4°; lavar em PBS 3 vezes durante 5 min. cada lavagem; bloquear em PGFN por 1h antes de começar a IFI.

· : IFI: diluir os soros primários em PGFN na diluição adequada; colocar 50µL do soro diluído sobre parafilme, inverter a lamínula sobre o soro e incubar 1h à temperatura ambiente em câmara úmida; lavar três vezes por 5 min. em PBS; diluir o conjugado em PGNF com 1% soro normal de cabra (Amersham), acrescentar HOESCHT na diluição 1:500; colocar 50µL do conjugado sobre o parafilme, inverter a lamínula e incubar 30 min. à temperatura ambiente em câmara úmida; lavar 3 vezes por 5 min. em PBS; montar com glicerina tamponada sobre lâmina de vidro. Caso seja IFI dupla, incubar cada soro em separado e cada conjugado em separado, colocando