Homem e sociedade

PCR - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

A reação em cadeia da polimerase é a amplificação enzimática de uma sequencia específica de DNA, visando à produção de milhões de cópias desta sequencia em um tubo ensaio. Essa técnica foi descrita por Kary Mullis no final dos a os 80 e tem revolucionado a genética molecular, pois possibilita uma nova estratégia na análise de genes por meio de um método simples e rápido de amplificação de sequencias, dispensando todas as trabalhosas etapas da clonagem gênica.

A PCR explora a capacidade de duplicação do DNA. Uma fita simples de DNA é usada como molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a ação da enzima polimerase do DNA, capaz de adicionar os nucleotídeos presentes na reação, segundo a fita molde. A polimerase do DNA requer, entretanto, um ponto inicio, ligado a fita molde que servirá de apoio para que os nucleotídeos subsequentes sejam adicionados. Esse ponto início da síntese é fornecido por um oligonucleotídeo que se hibridiza (se anela) à fita molde simples, o qual é denominado de primer. Ambas as fitas simples iniciais servem de fita molde para síntese, desde que se forneça primers específicos a cada uma delas. Dessa forma, a região do DNA genômico a ser sintetizada é definida pelos primers, que se anelam especificamente as sua sequencia complementares na fita molde, delimitando o fragmento de DNA que se deseja amplificar.

Na prática o que se faz é adicionar em um tubo de ensaio uma quantidade muito pequena de DNA genômico, mais os quatro nucleotídeos que compõem a cadeia de DNA, a enzima polimerase do DNA, os oligonucleotídeos que servirão de primers e a solução tampão, que fornecerá as condições de pH e salinidade para que a síntese se processe. O tubo de ensaio é submetido a uma lata temperatura (geralmente 94°C por 5min) para provocar o rompimento das pontes de hidrogênio entre ambas as cadeias de DNA, causando a desnaturação da molécula. A temperatura é rebaixada (30 a 65°C por segundos)