clonagem

Clonagem Molecular e Expressão de Proteínas
Vivian Tamietti Martins

Belo Horizonte
2013

Clonagem
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Processo de fazer cópias exatas de um organismo (Clonagem Reprodutiva), de uma celula (Clonagem Celular) ou de moléculas do organismo (Clonagem molecular). Clonagem Reprodutiva

Clonagem Celular

Clonagem molecular

Vetores de clonagem
Veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA sejam clonados e propagados em uma célula hospedeira adequada.

Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA que tem 3 características fundamentais:
• É capaz de replicar independentemente do cromossomo da célula hospedeira → Origem de replicação.
• Organismos contendo o vetor podem se desenvolver preferencialmente em um dado meio, pois o vetor confere ao organismo alguma propriedade que lhe permite este crescimento preferencial →
Resistência a antibiótico.
• O vetor aceita a inserção de DNA exógeno em sua molécula de DNA →
Sítios de clonagem.

Inserto de DNA
O fragmento de DNA pode ser :
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cDNAs sintetizados a partir de mRNAs;
Produto de digestão de DNA genômico com enzimas de restrição;
DNA dupla fita de qualquer origem;
Produto de PCR.
É um procedimento que possibilita a amplificação in vitro de fragmentos de DNA específicos partindo-se de uma quantidade mínima de DNA.

Para realização da PCR são necessários: - DNA molde (100ng);
- Primers;
- dNTPs (A,G,C,T);
- DNApolimerase;
- MgCl2;
- Tampão.

Eletroforese em gel de agarose
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Método simples e eficiente que permite separação, identificação e purificação de moléculas de DNA.

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As moléculas são separadas através da migração de partículas no gel, com a aplicação de uma diferença de potencial elétrico, onde as moléculas de menor massa migram mais rápido.

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A adição do brometo de etídeo permite a visualização da banda de
DNA quando está frente à radiação ultravioleta.

Enzimas de Restrição
Clivam sequências específicas em ambas as