Caracterização biofísica

O vírus da hepatite C (HCV) infecta aproximadamente 150 milhões de pessoas no mundo, constituindo assim um grande problema mundial. A infecção por HCV causa uma infecção crônica podendo levar à fibrose hepática. Pertencente à família Flaviviridae, o HCV é um vírus envelopado cujo genoma é composto por um RNA de fita simples com polaridade positiva. Ele contém aproximadamente 9,600 nucleotídeos que codificam uma poliproteína, que é posteriormente clivada tanto por proteases virais quanto do hospedeiro em 10 proteínas. Dentre elas, destaca-se a proteína não estrutural 5 (NS5B), que possui atividade RNA polimerásica dependente de RNA (RdRp). Esta proteína é a principal enzima responsável pela replicação do genoma viral.
Com o objetivo de estudar características biofísicas da proteína NS5B e desenvolver uma metodologia não radioativa para o estudo de sua atividade que possa ser futuramente utilizada para varredura de possíveis inibidores. O seu gene foi clonado em diferentes plasmídeos para a expressão da proteína recombinante (rNS5B) em bactéria E. coli. Para facilitar a posterior etapa de purificação, a proteína rNS5B foi expressa fusionada a uma cauda poli histidina. Assim, a técnica de cromatografia de afinidade em coluna Ni+2NTA foi utilizada para obtenção da rNS5B pura. Ao final, observamos que a proteína apresentava alto grau de pureza (> 95%). Com o objetivo de verificar se a proteína rNS5B apresentava função, foram realizados ensaios de polimerização com sonda radioativa (teste padrão). Os resultados revelaram que esta proteína exibia atividade polimerásica conforme esperado. Em seguida, ela foi utilizada para validação do ensaio de atividade não radioativo xviii desenvolvido neste trabalho. Para avaliar a estabilidade da rNS5B frente à ação de agentes caotrópicos, foram realizados estudos espectroscópicos nos quais a proteína NS5B foi submetida à ação de diferentes agentes desnaturantes físicos e químicos.