APLICAÇAO DO PCR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
LGN 5799 – Seminários em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de Genética
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - SP http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php EXPRESSÃO GÊNICA E DIAGNÓSTICOS. APLICAÇÕES DO PCR EM
TEMPO REAL
O PCR consiste em amplificar cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. É o método para rápida amplificação de seqüências específicas de DNA. A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores, que são oligonucleotídeos com 20-24 bases usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade. Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos iniciadores serve como molde para a síntese de uma nova fita, isso garante o aumento exponencial do número de novas fitas.
O PCR convencional não apresenta valores quantitativos, por isso foi desenvolvido o PCR em tempo real, que é uma técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas produzidas a cada ciclo. As características relevantes do PCR em tempo real são rapidez, especificidade, sensibilidade e quantificação. A amplificação é dividida em 3 fases: a linha basal na qual não há produtos de PCR suficientes para detectar fluorescência, a fase log em que a quantidade de produtos de
PCR dobra a cada ciclo e a fase platô onde não há mais aumento no número de produtos.
No PCR em tempo real existem dois métodos de quantificação: a detecção não-específica e a específica. O Syber Green é o exemplo mais utilizado de detecção não-específica, no qual fluoróforos fluorescentes se ligam à fita-dupla de DNA, emitindo fluorescência. O TaqMan e o Molecular Beacon são sondas altamente específicas a seqüência alvo, liberando fluorescência apenas na presença do produto de PCR de interesse. Eles são capazes de realizar reações