Análise por PCR

Extração, quantificação e amplificação de DNA
Data: 02/04
Extração de DNA – Swab oral
Nessa aula foi feito a coleta de amostra biológica através de swab oral, para extração do DNA. Para a extração foi utilizado o protocolo abaixo:

Adicionar 200 μL de amostra biológica em tudo 1,5mL;
Centrifugar a solução por 5 min., 25°C e 11000rpm;
Descartar sobrenadante;
Adicionar 500 μL de TE (Tris-EDTA);
Centrifugar a solução por 5 min., 25°C e 11000rpm;
Descartar sobrenadante;
Adicionar 800 μL de água milli-Q autoclavada;
Centrifugar a solução por 5 min., 25°C e 11000rpm;
Descartar sobrenadante;
Adicionar solução tampão:
240 μL de água milli-Q autoclavada
80 μL de 5x tampão de Proteinase K (10mM Tris-HCl, pH 7,8, 5mM EDTA e 0,5% SDS)
40 μL de SDS 10%
20 μL de Proteinase K, 20mg/mL
Incubar por 30 min. a 58°C (ou deixar overnight a 56°C);
Adicionar 120 μL de NaCl 5M;
Centrifugar a solução por 10 min., 25°C e 11000rpm;
Transferir o sobrenadante (DNA) para outro tudo de 1,5mL;
Adicionar 800 μL de etanol absoluto;
Centrifugar a solução por 10 min., 4°C e 11000rpm;
Descartar o sobrenadante;
Adicionar 500 μL de etanol 70%;
Centrifugar a solução por 10 min., 4°C e 11000rpm;
Descartar o sobrenadante;
Deixar o pellet secando e ressuspender em 30 μL de água.
(Guardou a -20°C)

Comentários:
Inicialmente os alunos coletaram a amostra do DNA com swab em mucosa oral e foi colocado em solução, para conseguir liberar as células na solução. Em seguida, foram feitas centrifugações por 5 min à 11000rpm para obter o pellet, com descarte de sobrenadante. Entre cada centrifugação foram feitas reações com soluções para retirar açúcares e outras moléculas que não são de interesse, permanecendo apenas as células contendo o DNA. Adicionou-se água milli-Q autoclavada, para realizar a lise das células e em seguida, adicionou-se uma solução tampão com SDS 10%, que é um detergente utilizado para quebrar as moléculas da parede celular e assim expor o DNA contido no núcleo