Microscopia de fluorescência

Microscopia de Fluorescência aplicada à Proteínas:
INTRODUÇÃO:
Esta técnica baseia-se na fluorescência ou fluorocromos (componente da molécula que atribui a fluorescência) para visualização. Estes se ligam a componentes da célula microbiana ( p. ex.ácidos nucleícos) e sob excitação ultravioleta ou radiação eletromagnética na faixa do visível de baixo comprimento de onda, emitem radiação com comprimento de onda superior à radiação incidente. Sendo assim, fluorescência é a propriedade de algumas substâncias que após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, emitem radiação de maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a energia da radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz visível. Moléculas coradas por um corante fluorescente aparecem como objetos luminosos quando observados com luz ultravioleta. É com os recursos desta técnica que se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando associados a anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes, e quantificam-se pelo processo de fluorometria os objetos de estudo da citoquímica normal e patológica (Taboga,2001).
A imagem observada é o resultado da radiação electromagnética emitida pelas moléculas que absorveram a excitação primária e tornam a emitir uma luz com maior comprimento de onda. Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se colocar filtros apropriados debaixo do condensador e por cima do objectivo. Usa-se para detectar substâncias com autofluorescência (vitamina A) ou substâncias marcadas com fluorocromos. A grande vantagem desta técnica é o ganho de contraste, porém requer custo adicional com aquisição de equipamentos. No campo da microbiologia, corantes fluorescentes tem papel relevante na contagem direta de bactérias no meio ambiente, dentre os fluorocromos mais utilizados estão “acridine orange” (3,6 – bis [dimethylamino] acridinium chloride [AO] e “DAPI” 4´, 6´- diamidino – 2 – phenylindole, isotiocianato de fluoresceína.