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Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de PCR “semi-nested” para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae

Teló E P, Schmitt V, Mombach A B, Chesky M

Hospital de Clínicas de Porto Alegre – Unidade de Microbiologia e Biologia Molecular

RESUMO

Mundialmente, as meningites bacterianas constituem importante causa demorbimortalidade na infância, exigindo um diagnóstico rápido e preciso no manejo dos pacientes. O objetivo deste estudo foi determinar o limite mínimo de detecção da técnica de PCR “semi-nested” “in house” para os três principais agentes causadores de meningites bacterianas: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae. Diluições seriadas de cada bactéria foram submetidas à técnicade PCR “semi-nested” para detecção simultânea dos três microorganismos, pela amplificação de uma região do gene bacteriano 16S rRNA. Os produtos finais foram amplicons específicos de diferentes pesos moleculares para N. meningitidis, H. influenzae e gênero-específico para Streptococcus sp. A forma de visualização dos resultados foi através de eletroforese em gel de agarose para a detecção dosprodutos da PCR. Determinou-se que o limite mínimo de detecção para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae foi respectivamente de 103, 102 e 104 UFC/mL.

PALAVRAS-CHAVE: Meningites bacterianas, PCR, Limite mínimo de detecção.

INTRODUÇÃO

As meningites bacterianas continuam sendo um grande problema de saúde pública no Brasil e no mundo, constituindoimportante causa de morbimortalidade na infância. Em todo o mundo, sem epidemias, um milhão de casos de meningite bacteriana são estimados para ocorrer, e dentro destes, 200.000 morrerão anualmente. O número de casos fatais varia com a idade, o tempo da doença e a espécie da bactéria causadora da infecção, mas tipicamente os casos fatais estão entre 3 a 19 % nos países desenvolvidos e 37 a 60 % nospaíses em desenvolvimento (1). As seqüelas neurológicas ocorrem em 5% a 30% dos sobreviventes, e devem-se principalmente ao retardo no estabelecimento do diagnóstico e no início do tratamento antimicrobiano eficaz (2). Diversos agentes bacterianos podem causar meningites piogênicas, entre os mais comuns estão a Neisseria meningitidis, o Haemophilus influenzae e o Streptococcus pneumoniae, sendoresponsáveis por mais de 90 % dos casos de meningites bacterianas (3,4,5).
A persistência global das meningites, em especial das causadas por Neisseria meningitidis, é devido ao significante número de portadores assintomáticos e à dinâmica de transmissão da doença. Estima-se que aproximadamente 500 milhões de pessoas em todo o mundo são portadoras de Neisseria meningitidis em suanasofaringe, sendo um importante fator de risco para a transmissibilidade da doença (6).
Fatores como a progressão acelerada da doença, o grande número de portadores e o modo de transmissão justificam o difícil manejo desta patologia e a necessidade de ferramentas diagnósticas mais rápidas, sensíveis e específicas.
A alta mortalidade e morbidade destas meningites e a demora na identificaçãodo patógeno através dos métodos microbiológicos tradicionais, exigem tratamento empírico com antibiótico. Entretanto, este procedimento resulta na queda da sensibilidade para identificação do agente etiológico no líquido cefalorraquidiano (LCR) pelos métodos convencionais de diagnóstico (7). A cultura, ainda considerada como “padrão ouro” no diagnóstico das infecções bacterianas, identifica oagente etiológico em 70 a 85 % dos casos de meningite bacteriana, mas sua sensibilidade cai para valores inferiores a 50 % nos pacientes que já receberam antibioticoterapia antes da realização da punção lombar (8).
O desenvolvimento da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) por Kary Mullis e colegas, na década de 80, revolucionou a análise baseada em ácidos nucléicos, permitindo a...
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