Digestão de amostras massa

Procedimento Digestão de amostras

Procedimento Amostras
- A amostra e os marcadores em duplicata foram corridos em gel de poliacrilamida 1D 12,5%. As amostras e o marcador estavam em ambos os extremos do gel;
- O gel foi divido em dois, um dos lados foi submetido a coloração com Comassie (gel 1) e descorado com solução metanol 10% e acido acético 5%. Neste gel foi identificado a região onde se encontrava a proteína;
- O gel não corado (gel 2) foi mantido em metanol 50% até a identificação das bandas;
- Após a visualização das bandas no gel 1, a região análoga no gel 2 foi cortada em pequenos fragmentos;
- Os fragmentos foram lavados 3x com tampão bicarbonato de amônio50mM pH 8,0 sendo esta solução desprezada após;
- Foi adicionado nos fragmentos solução (1:1) de acetonitrila e bicarbonato de amônio 50mM pH 8,0 e esta removida no speed-vac;
- Os géis foram cobertos com tampão bicarbonato de amônio 50mM pH 8,0 contendo tripsina 12,5ng/ul e 2 mM de cloreto de cálcio overnight 37°C;
- Os géis foram centrifugados 16000 g e o sobrenadante recolhido em novo tubo;

- Os géis foram ainda lavados com solução (1:1) de acetonitrila e bicarbonato de amônio 50mM pH 8,0;
- Os géis foram centrifugados 16000 g e o sobrenadante recolhido junto com o sobrenadante da digestão;

- O tubo contendo os sobrenadantes foi seco no speed-vac;

- A alíquota foi resuspendida em 20µl de H2O miliQ; Protocolo Gel de Agarose
- Posicionar os suportes dentro do gel;
- Em tampão Tris-HCl 25mM pH 8,0 foi dissolvido (1-5%) de agarose
Para um gel de 11x14 de espessura 1,5cm utilizar 240ml de agarose para espessura de 1cm utilizar 160ml de agarose, preparar um pouco a mais devido a perdas por evaporação (0,5cm para amostras com pouca amostra);
- A mistura foi aquecida em microondas e agitada até tornasse transparente
Obs: De 5 artigos apenas um realiza gel de agarose 5% para separar proteínas com massa em torno de 40kDa todos os outros utilizam usam geis de 0,8-1%
- Como