Cromatografia

TP5.2
Electroforese, isolamento e quantificação de ácidos nucleicos
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Electroforese
• Método analítico de separação de moléculas de diferentes dimensões.
• Migração das moléculas através de um gel, que constitui uma matriz porosa.

Poliacrilamida

Separação de proteínas

Agarose

Separação de DNA/RNA

Gel

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Electroforese
Sistema horizontal: gel de agarose

Separação de DNA/RNA

Sistema vertical: gel de poliacrilamida

Separação de proteínas

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Electroforese
• Criação de um campo eléctrico que força o movimento das moléculas.
• O pH do tampão de electroforese, proteínas e ác. nucleicos possuem carga negativa logo migram para o polo positivo.
‐

2500 pb
300 pb

+
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Electroforese

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Electroforese
Fragmentos pequenos correm mais depressa no gel

Agarose

Diferentes gamas de resolução Rede mais apertada

% de agarose no gel
0,3
0,6
0,7
0,9
1,2
1,5
2,0

Gama de separação de moléculas lineares de DNA (Kb)
60 ‐ 5,0
20 ‐ 1,0
10 ‐ 0,8
7 ‐ 0,5
6 ‐ 0,4
4 ‐ 0,2
3 ‐ 0,1
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Electroforese
Pode ser usado como método preparativo:
1. Separar fragmentos de DNA

2. Depois purificar fragmentos de DNA específicos 3. Cortar a banda e recuperar o DNA do gel

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Electroforese

Tampão de