Clonagem dna

Clonagem de DNA

1 - Formar DNA recombinante

Bactérias estão sobre constante ataque de bacteriófagos (virus). bacteriófago s bacteriófago s bacteriófago s bacteriófago s bacteriófago s

Enzimas de restrição
Para se protegerem muitas desenvolveram um sistema para destruir DNA estranho (por ex dos bacteriófagos, impedindo assim o seu ataque).
●

São endonucleases--(enzimas de restrição, porque restringem a infecção por bacteriófagos) Corta qualquer DNA que entra na bactéria

●

PORQUE Não é destruído o seu próprio DNA?
Possuem um gene que impede as Enz Rest de atacar o próprio DNA cromossomal

2- Uso de plasmídeos

(vectores de clonagem)

3 - Transformação

4 - Reconhecimento

dos clones transformados

Transformação
Preparação de células competentes
Transformação química - CaCl2 e choque térmico Transformação eléctrica - Choques eléctricos Adição de DNA recombinante construído in vitro E.Coli- célula hospedeira cromossoma

Transformação
Situações que podem ocorrer:

1 3

1. E.Coli + DNA recombinante 2. E.Coli + plasmídio 3. E.Coli sem plasmídio
Lima, N.; Mota, M. 2003. Biotecnologia. Fundamentos e Aplicações. Edições Técnicas. pp. 130.

2

Que estratégias utilizar para seleccionar as células com DNA recombinante?
Marcas de selecção do vector

Inserção de DNA estranho

Resistência a antibióticos - Ampicilina

Lac Z AmpR

Actividade da β-Galactosidase (gene Lac Z)

Origem de replicação

www.science.uwaterloo.ca/course-notes/biology

Resistência à ampicilina
Transformação

Selecção das células com plasmídios

Célula com plasmídio

Células sem plasmídios

Célula com plasmídio

Como seleccionar as células com DNA recombinante?
Meio de cultura com ampicilina www.science.uwatterloo.ca/course-notes/biology Actividade da β-Galactosidase
Gene Lac Z desintegrado

Gene Lac Z intacto β-Galactosidase

β-Galactosidase

X-Gal

Pigmento azul Meio de cultura com ampicilina

+
X-Gal