Cancer de mama

Disponível somente no TrabalhosFeitos
  • Páginas : 7 (1676 palavras )
  • Download(s) : 0
  • Publicado : 11 de outubro de 2012
Ler documento completo
Amostra do texto
FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS







Biologia Molecular









Relatório de práticas em técnicas de Biologia Molecular





Carlos Cesar Alves da Costa

Rafael de Moraes Petecof




Introdução



Para extrair DNA de sangue, este deve ser centrifugado e lavado repetidas vezes com tampão TE (LIMA et al, 2009). Procedimentos de extração de DNA desangue envolve, primeiramente, a separação dos leucócitos, formando um pellet destes por centrifugação. Subsequentes procedimentos objetivam lizar leucócitos e precipitar proteínas, precipitar DNA, lavar DNA e por fim hidratar o DNA (CABOUX et al, 2012).

Proteinase K e solventes orgânicos são frequentemente usados para extrair DNA (BAREA et al, 2004). A extração de DNA comfenol-clorofórmio resulta em melhores amostras de DNA (ABRÂO et al, 2005).

Embora seja comum o uso de leucócitos periféricos para se extrair DNA, a extração também pode ser feita a partir de células da mucosa oral como alternativa às amostras sanguíneas (ABRÂO et al, 2005). As células de epitélio bucal podem ser obtidas por raspagem da mucosa das bochechas, através de algodão estéril em uma haste(BAREA et al, 2004).




Para determinar a pureza de DNA verifica-se o índice de absorbância da amostra em comprimento de onda de 260 nanômetros, para o DNA, e divide-se pelo índice de absorbância da amostra em 280 nanômetros de comprimento de onda, para proteínas (ROSA, 2008).











Objetivo




O objetivo dos experimentos foi extrair materialgenético (DNA) a partir das amostras de sangue periférico e epitélio bucal, assim como analisar se houve a extração dos ácidos nucléicos através da eletroforese. Comparar os resultados: Salting-out com clorofórmio (leucócitos) e salting-out sem clorofórmio (leucócitos e células de epitélio bucal).




Materiais e métodos




Quanto aos métodos foram testados dois protocolos para extrairDNA de leucócitos, extração de DNA pelo método salting-out convencional sem adição de clorofórmio e outro com a adição do mesmo, e um método salting-out sem clorofórmio para extrair DNA de células do epitélio bucal.

Para avaliação da presença e integridade do DNA foi aplicada a técnica de eletroforese de ácidos nucléicos. Foi utilizada a espectrofotometria para verificar a pureza dasamostras de DNA obtidas.

O comprimento de onda para o DNA é 260 nm e para proteínas é 280 nm. A razão da absorbância do DNA sobre a absorbância da proteína deve estar entre 1,8 e 2 para indicar DNA livre de proteínas.











Extração de DNA genômico (Salting-out) a partir de leucócitos (sem clorofórmio).

1. Para cada 4 ml de sangue, acrescentar TE até completar 10ml, em tubo graduado de centrifuga (falcon) de 15 ml.

2. Homogeneizar por inversão e centrifugar à 4000 rpm por 10 minutos.

3. Desprezar o sobrenadante, completar com TE até 10 ml, e lavar o pellet com TE por agitação até que o pellet esteja totalmente dissolvido.

4. Recentrifugar a 4000 rpm por 8 minutos.

5. Repetir as etapas 3 e 4 de maneira que o pellet torne-se esbranquiçado.

6.Adicionou-se ao pellet 300 μl de Buffer A e ressuspender completamente o pellet.

7. transferiu-se o conteúdo para um eppendorf de 1,5 ml.

8. Adicionou-se 20 μl de SDS a 10%. Homogeneíza-se por inversão.

9. Adicionou-se 10 μl de Proteinase K. Homogeneíza-se por inversão.

10. Incubar a 60°C por 20 minutos.

11. Adicionar 100 μl de NaCl 5 M (Agitar vigorosamente por 10 minutos).12. Centrifugar a 8000 rpm durante 15 minutos.

13. Transferiu-se cuidadosamente o sobrenadante a tubo novo.

14. Adicionou-se no tubo novo 1000 μl de Etanol absoluto gelado.

15. Misturar por inversão vagarosamente até o aparecimento de um precipitado fibrilar.

16. Centrifugar a 10.000 rpm por pelo menos 10 minutos.

17. Descartar o sobrenadante por inversão (cuidadosamente)

18....
tracking img