Bioquimica 3 - clonagem dna

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
Departamento de Genética e Evolução
Bioquímica III









Clonagem de DNA









Prof.ª: Dra. Maria Teresa Marques Novo
Leonardo Teixeira Matos
Letícia Priori Canesqui 300942
Luiz Eduardo P. Araújo 301191
Priscilla Rodrigues Marques 300918
Rafaela Costa Carmona 301000
Thiago Corrêa Porto Kastein 313750





São Carlos,dezembro de 2009.


1. INTRODUÇÃO
O termo clonagem refere-se à reprodução de células-filhas por fissão ou divisão mitótica. Durante esses processos, o DNA da célula parental é replicado e os conjuntos idênticos de informação genética são passados para as células-filhas. Gerações sucessivas de células dividem-se, originando uma população de clones geneticamente idênticos, todos derivados apartir de uma única célula ancestral1.
A clonagem genética utiliza-se da habilidade natural de as células duplicarem o seu DNA durante a mitose. De uma maneira geral, o gene de interesse é inserido em uma molécula de DNA carregadora, chamada de vetor. O vetor com o seu gene inserido é introduzido (transformado) na célula hospedeira apropriada, na qual ele se duplica juntamente com seu DNA.Mitoses subseqüentes do hospedeiro criam uma população de “clones”, cada um contendo o gene de interesse. A partir dessa população, o gene inserido pode ser reproduzido em quantidades necessárias para a pesquisa1.
O vetor é introduzido na célula atrasvés da transformação que torna as células competentes para viabilizar a introdução do DNA recombinado (rDNA) no hospedeiro selecionado2.Vetores são moléculas de transporte. São moléculas de DNA e podem ser de diversos tipos como por exemplo: plasmídios, cosmídios e fagos. As características gerais de um vetor são: presença de uma região promotora, sítios de clonagem, gene de resistência a antibióticos e origem de replicação.
Quando se utilizam plasmídeos em experimentos, é importante saber distinguir as células que realmentecontém os plasmídeos e as células que não os contém. A maioria dos plasmídeos contém genes que codificam proteínas marcadoras seletivas, o tipo mais comum de marcação e a resistência aos antibióticos, apenas as células que contenham o plasmídeo com resistência para aquele antibiótico podem sobreviver1.
Um método rápido para fazer uma pequena preparação de DNA plasmidial purificado a partirde volumes de cultura pequenos é chamado de minipreparação, as amostras de são isoladas e os plasmídeos originais são normalmente cortados com a mesma enzima de restrição usados para fazer as construções recombinantes.
As endonucleases de restrição permitem que os cientistas cortem precisamente o DNA de uma maneira previsível e reproduzível.
Existem 3 classes principais deendonucleases de restrição, tipos I, II e III. As enzimas do tipo I e III possuem tanto atividades de restrição quanto de modificação e elas cortam o DNA em sítios fora de suas seqüências de reconhecimento. As endonucleases de restrição tipo II são ideais por várias razões, possuem atividade de restrição, mas não de modificação, cortam de maneira previsível e consistente, em um sítio dentro ou adjacente daseqüência de reconhecimento1.
Os fragmentos de DNA resultantes de uma digestão com endonucleases de restrição eram originalmente separados pela velocidade de sedimentação por ultracentrifugação. Em 1970, Daniel Nathans usou a eletroforese de poliacrilamida como uma maneira simples e rápida de separar fragmentos de DNA.
Após refinamentos importantes na eletroforese em gel, foipossível a análise de padrões de restrição de DNA; substituiu-se a poliacrilamida pela agarose e passou-se a utilizar marcadores fluorescentes como o brometo de etídio para marcar as bandas de DNA nos géis de agarose.
Na técnica de eletroforese (figura 1) atual a agarose fundida é vertida em uma bandeija de distribuição na qual está suspenso um pente de plástico. Assim que se resfria, a agarose...
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