Biologia molecular

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  • Publicado : 8 de abril de 2012
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INTRODUÇÂO:
O processo de transformação bacteriana permite a inserção de plasmídeos contendo genes, para clonagem ou expressão, em bactérias. Dentre os métodos conhecidos, podemos destacar doisprincipais: o método químico que consiste na incubação com altas concentrações de íon Ca+2, o que leva a membrana plasmática bacteriana a admitir o DNA plasmideal e a eletroporação. A eletroporaçãopermite uma alta eficiência de transformação, pois utiliza descarga de capacitores para produzir pulsos de alta voltagem induzindo poros reversíveis em membranas celulares, resultando em fluxo de íons emoléculas através da membrana deformada. Altos níveis de permeabilização facilitam a entrada de DNA, entretanto, diminuem a viabilidade da célula. Portanto, é necessário estabelecer uma curva deviabilidade da célula em relação aos parâmetros aplicados. As condições para a máxima eletroporação diferem entre diferentes espécies e mesmo entre cepas (SCHAEFER, 2006).
Após a transformação dasbactérias competentes, isto é, das bactérias capazes de absorver DNA, elas são selecionadas pelo crescimento em cultura contendo um antibiótico específico. Bactérias que albergam uma ou mais cópias de umplasmídeo expressam o gene que confere resistência a um antibiótico, portanto, sobrevivem ao plaqueamento (SCHAEFER, 2006).


MATERIAIS E EQUIPAMENTOS:
Cubeta, produto de ligação, tubo eppendorfde 1.5 ml, gelo, célula eletrocompetente, placas de petri, meio LB ágar com antibiótico (ampicilina), meio LB líquido, alça plaquear, ponteira de 10 (l, 100 (l e 1000 (l, pUC18, Shaker 37º C, capela,eletroporador.


SOLUÇÕES:
Meio de cultura LB:
NaCl 10 g; Peptona 10 g; Extrato de levedo 5 g.
Os componentes foram adicionados em um béquer contendo 800 ml de H20 e aguardou-se até a completadissolução dos mesmos. A solução já diluída foi transferida para uma proveta e o volume foi completado para 1 litro. O pH foi acertado para 7.2 e após misturar bem, o meio foi autoclavado por 20...
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