Trabalho de genética sobre pcr

Aluna: Ivone de Oliveira Lima Monteiro UC06015273 – Turma NHA (4G e 4H) 1. EXPLIQUE O FUNCIONAMENTO DA TÉCNICA DE PCR. E CITE ALGUMAS DE SUAS APLICAÇÕES. A técnica de PCR (reacção em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo. Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. Para amplificar uma determinada região são necessários dois iniciadores complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar. Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
➢ Desnaturação do DNA alvo pelo calor (1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias.
➢ Associação dos iniciadores por ligações de hidrogênio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reação é arrefecida (a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
➢ Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente. Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 225 vezes