Sequenciamento de dna pela plataforma 454

SEQUENCIAMENTO DE DNA PELA PLATAFORMA 454

As novas tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de sequenciamento de nova geração, começaram a ser comercializadas em 2005. E estão evoluindo rapidamente. Todas essas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. Dentre as novas plataformas de sequenciamento, duas já possuem ampla utilização em todo o mundo: a plataforma 454 FLX da Roche e a Solexa da Illumina.em síntese, o pirosequenciamento (RONAGHI et al., 1998). A leitura da sequência nesse sistema é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas que se inicia com a liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de umdesoxinucleotídeo à cadeia. Em seguida, esse pirofosfato é convertido para ATP, pela ATP sulfurilase, sendo este utilizado pela luciferase para oxidar a luciferina, produzindo um sinal de luz

O sistema requer que o DNA seja mecanicamente fragmentado em sequências de 300 – 800pb, transformado em fragmentos abruptos fosforilados e ligado a adaptadores de sequência específica (Figura 1). A biblioteca de DNA da amostra é ligada a adaptadores A e B nas extremidades 3’ e 5’ dos fragmentos, respectivamente, os quais são utilizados nas etapas posteriores de isolamento dos fragmentos (A-B) e amplificação e nas reações de sequenciamento. O adaptador B possui biotina ligada à extremidade 5’, o que permite o isolamento dos fragmentos ligados ao adaptador A na extremidade 3’ e adaptador B na extremidade 5’ na amostra. Somente os fragmentos AB são eluídos na reação de purificação e são especificamente ligados às microesferas que carregam várias cópias da sequência complementar exata ao adaptador B de um único fragmento (MARGULIES et al., 2005). O outro adaptador é utilizado no anelamento do primer que inicia a reação de sequenciamento. As microesferas ligadas aos fragmentos únicos de fita simples são então emulsionadas em uma