Western Blot

POP - PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

Western Blot (Sistema BioRad)
12-04-2012

1.0 – Processamento da amostra

1. Colocar um 0,03g de aorta em 200 µL tampão de extração RIPA com inibidores (final do POP) e triturar no Politron, depois deixar neste tampão por no mínimo 1 hora sob agitação a 4ºC, para extrair as proteínas. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 min. Recolher o sobrenadante que poderá ser congelado (80ºC) e utilizado posteriormente;
2. Após este procedimento dosar a quantidade de proteínas das amostras pelo método de Bradford.

2.0 – Preparo dos géis

O tamanho da proteína a ser avaliada determinará a porosidade do gel de separação SDS/PAGE:

Tamanho da protein (kDa) Porcentagem do gel
4-40 20
12-45 15
10-70 12,5
15-100 10
25-200 8

1. Separar as placas, pente(s) e espaçadores a serem utilizados na preparação do gel. O pente escolhido deve ter a mesma espessura dos espaçadores selecionados;
2. Lavar e secar as placas, pente(s) e espaçadores;
3. Colocar os três espaçadores sobre a placa 01 deixando um espaço nas extremidades.

Placa 01 Placa 02

4. Certificar-se de que apareceram as 2 pontas do espaçador inferior para fora do conjunto das placas;
5. Colocar a placa 02 sobre a placa 01 e prender com os grampos (2 de cada lado, com exceção do lado superior);
6. Verificar se o pente escolhido se encaixa por entre as placas;
7. Retirar a agarose do refrigerador e levar ao forno de microondas até notar a sua fusão completa (cuidado, pois a solução pode derramar ao entrar em ebulição), caso seja necessário, diluir a solução.
8. Utilizando uma pipeta Pasteur, colocar agarose nos três lados da placa a fim de vedá-la. Lavar imediatamente a pipeta Pasteur com água destilada para evitar que a agarose se polimerize dentro da pipeta;
9. Colocar água destilada por entre as placas até em cima, a fim de verificar se a câmara de vidro está bem vedada. Aguardar