Técnicas em biomol

Páginas: 8 (1779 palavras) Publicado: 22 de novembro de 2012
Técnicas em Biologia Molecular DNA recombinante; enzimas de restrição; clonagem gênica; sequenciamento; PCR; aplicações médicas

DNA recombinante: o que é?
• É uma molécula de DNA gerada pela união de dois pedaços DNA que não se encontram associados normalmente, em geral derivados de organismos diferentes.

DNA recombinante: para que serve
• Isolar um gene de interesse de estudo paraconhcer sua sequência ou para expressar seu produto para fins de pesquisa ou biotecnológico • Ex: insulina, hormônio de crescimento, vacinas

Como começou esta tecnologia
• 1953: DNA de uma cepa de E.coli (B), quando introduzido em outra cepa de E.coli (C), era rapidamente clivado em pequenos fragmentos. O mesmo ocorria com DNA de vírus (bacteriófagos) que não infectam normalmente a cepa C. •Extratos de E. coli (C) quebravam moléculas de DNA de diversas origens, mas não o DNA de suas células. E no caso de alguns vírus, o DNA não era clivado, e o vírus era capaz de se replicar na bactéria. • 1960s: análise de DNA viral que não era quebrado revelou várias modificações no DNA, não presentes em DNAs sensíveis a quebra.

Sistema metilação/restrição do DNA
• Diferença entre DNA clivado eDNA que não era clivado: • bases metiladas no DNA, não presentes em DNAs sensíveis • Cepas bacterianas possuem metilases que adicionam grupos metil – CH3 - às bases em sequências específicas do DNA
este DNA era clivado este DNA não era clivado

Sistema metilação/restrição do DNA
• 1970s: uma nuclease foi purificada da bactéria Hemophilus influenza • A nuclease se ligava a moléculas de DNA emdeterminada sequência de bases, cortava o DNA dentro desta sequência (hidrolizava a ligação fosfodiester) gerando uma extremidade 5`fosfato e uma 3`OH, • mas não quebrava o DNA da própria bactéria, metilado na *A (*N6metiladenina)

Sistema metilação/restrição do DNA

• isoladas de diversas espécies e cepas bacterianas (milhares já isoladas) • enzimas cortam o DNA em sítios específicos de 4-8nucleotídeos

Sistema metilação/restrição do DNA
A cada enzima de restrição corresponde uma metilase, que adiciona grupo –CH3 a uma das bases do sítio de reconhecimento da enzima

Enzimas de restrição

• estas enzimas foram chamadas de " enzimas de restrição“ porque restringem a entrada de DNA exógeno na bactéria • “sistema imune“: destrói DNA estanho • as metilases protegem o DNA contradigestão pelas endonucleases correspondentes

Enzimas de restrição
•A maioria das enzimas reconhece e corta dentro de sequências palindrômicas

•muitas geram DNAs com pontas coesivasfragmentos de DNA com pontas em fita simples •Outras geram pontas cegas, cortam as 2 fitas de DNA no mesmo ponto
ER ER ER

Extremidades coesivas

Extremidades cegas

Enzimas de restrição: aplicação em DNArecombinante
• os fragmentos gerados podem se ligar a pontas complementares de outros fragmentos de DNA clivados com a mesma enzima e assim para produzir moléculas recombinantes • Pode-se assim unir fragmentos de origens diferentes (organisnos diferentes)

Clonagem de DNA
• Se insere um pequeno fragmento de um genoma (DNA de interesse, gene) em um vetor • Vetor: DNA capaz de se replicarautonomamente, independente do cromossomo • gera-se um DNA recombinante.

Clonagem de DNA
• vetor contendo o DNA de interesse (DNA recombinante) é inserido em um organismo hospedeiro (bactéria, por ex.) • Dentro do hospedeiro o vetor se replica (replicação de DNA), independentemente do genoma do hospedeiro e num número bem maior de cópias • Há amplificação do número de cópias do DNA recombinante. •A propagação do organismo hospedeiro, contendo o DNA recombinante, gera um conjunto de organismos geneticamente idênticos, um clone • processo é conhecido como clonagem de DNA

Clonagem de DNA
Como manter este valioso clone recombinante? Os vetores em geral possuem um marcador genético, i.e., um gene que permite que a célula hospedeira que tenha o DNA recombinante seja diferenciada das que...
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